Eijsink, V.G.H.、GÅseidnes, S.、Borchert, T.V.、Van Den Burg, B.
“定向进化酶的稳定性”
《生物分子工程 (Biomolecular Engineering)》,第 22 卷第 1-3 期,第 21-30 页。(2005) 

摘要

现代酶的开发越来越依赖于基于多样性生成,然后筛选具有优化性质的变体的策略。在原则上,这些定向进化策略可以用于优化任何酶性质,即使该性质的分子基础未知,也可以经济可行的方式进行筛选。稳定性是酶的一个有趣性质,因为 (1) 具有重要的工业意义,(2) 相对容易筛选,(3) 稳定性的分子基础与蛋白质科学中的当代问题密切相关,如蛋白质折叠问题和蛋白质折叠疾病。因此,工程酶的稳定性具有商业价值和科学价值。在这里,我们回顾了定向进化如何促成了稳定酶的开发和对蛋白质稳定性原理的新认识。文中描述了最近的数个示例。这些示例表明定向进化是获得稳定酶的有效策略,特别是与理性或半理性工程策略结合使用时。关于蛋白质稳定性的原理,从近期定向进化的研究中学到的一些重要经验是:(1) 用于稳定蛋白质的结构性方法有许多,并不总是容易合理化;(2) 蛋白质可能通过优化其表面来很好地加以稳定,以及 (3) 可以获得较高的热稳定性,低温下不丧失催化性能。© 2005 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

J.R Cherry;A.L.Fidantsef.
“工业酶定向进化:更新”
《生物技术新见 (Curr Opin Biotechnol.)》,第 14 卷第 4 期,438-43 (2003)

摘要

在工业过程中使用酶通常可以避免使用高温、有机溶剂和极端 pH 值,同时提高反应特异性、产品纯度并降低环境影响。工业酶的广泛使用取决于通过不断的创新来提高性能并降低成本。推动这种创新的因素包括快速增长的天然酶多样性数据库、重组 DNA 和发酵技术,以及蛋白质修饰工具,前者实现以较低成本产生这种多样性,后者能对酶进行调整以适应工业市场。

 

J.E.Ness;S. Kim;A. Gottman;R. Pak;A. Krebber; T.V.Borchert;S. Govindarajan; E.C.Miundorff;J. Minshull.
“合成改组通过允许氨基酸独立重组来扩展功能性蛋白质多样性”
《自然生物技术 (Nature Biotechnology)》,第 20 卷,1251-1255 (2002)

摘要

我们描述了合成改组,通过这种进化蛋白质工程技术,来自一对父母的每个氨基酸均被允许独立于任何其他氨基酸进行重组。通过使用简并寡核苷酸,合成改组提供了从数据库序列信息至功能库的直接途径。身体起始基因是不必要的,并且还可以引入额外的设计标准,如最佳密码子使用或已知的有益突变。我们对 15 个枯草杆菌蛋白酶基因进行了合成改组,并获得了具有所需性质组合的活性和高度嵌合酶,这是通过其他定向进化方法所无法获得的。

 

S. Danielsen;M. Eklund;H-J.Deussen;T. GrSslund;P-Å.Nygren;T.V. Borchert.
“使用基于机制的抑制剂从噬菌体库体外选择酶活性脂肪酶变体”
《基因 (Gene)》,第 272 卷,267-274 (2001)

摘要
为了识别在存在洗涤剂条件下具有改进特性的新酶变体,组合蛋白质工程/噬菌体展示方法对来自绵毛嗜热丝孢菌的“去污剂脂肪酶”Lipolasel((R)) 进行检测。首先证实野生型 Lipolase((R)) 可以在保留完整活性的大肠杆菌中产生,并显示为与大肠杆菌噬菌体 M13 上的外壳蛋白 3 融合的活性酶。然后构建利用每个脂肪酶基因设计得到约 2 - 3 个突变的噬菌体库。靶向位于靠近活性位点的两个区域内的 9 个氨基酸进行随机化。使用基于机制的生物素化抑制剂进行的选择显示,展示 Lipolase((R)) 的噬菌体可以从对照噬菌体群体中特异性富集。在存在抑制剂和市售洗涤粉条件下对库噬菌体原液的选择导致活性克隆的比例逐步增加。对 84 个活性克隆的分析显示,它们均表达脂肪酶活性,但活性低于野生型 Lipolase((R))- 生产克隆。在 7 个最活跃克隆的 6 个中,第 83 位野生型丝氨酸被苏氨酸取代,已知该取代改变了 Lipolase((R)) 变体的基质链长度偏好。此外,该选择丰富了在一个杂色区域中具有高度保守性的酶变体,表明该区域对于酶活性非常重要,并且设计的选择程序具有相关性。选择的变体主要包含其他杂色区域内的碱性氨基酸残基。总之,描述的结果表明,可以为这种酶类设计基于酶活性的选择方案,这对于未来的蛋白质工程尝试应该非常重要。