Bonnin, E.、Clavurier, K.、Daniel, S.、Kauppinen, S.、Mikkelsen, J.D.M.、Thibault, J.-F.
“曲霉菌中的果胶乙酰酯酶能够对同聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸聚糖进行脱乙酰基化”
《碳水化合物聚合物 (Carbohydrate Polymers)》。​在编文章。(2008)

摘要
基于对同聚半乳糖醛酸进行脱乙酰基化的能力,乙酰酯酶从棘孢曲霉中分离纯化。制备并使用一系列表征明确的底物来研究其特异性,包括具有不同甲基化和乙酰化程度的果胶、具有不同结构的果胶域及低聚物。然后,与之前从相同真菌中分离的鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶进行比较。这两种酶对各种乙酰化果胶均有活性,能够在不同程度上从经过乙酰化的同聚半乳糖醛酸、低聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸聚糖中释放乙酰基。因此我们推断,虽然这两种酶的效力不同,但均为果胶乙酰酯酶,能够在果胶的“平滑”和“毛状”部分发生反应。© 2008 Elsevier Ltd. 保留所有权利。

 

Wang, B.、Wu, W.、Liu, X.
“通过洛斯里被毛孢的杀线虫活性对中性丝氨酸蛋白酶进行纯化和表征研究”
《真菌病理学 (Mycopathologia)》,第 163 卷第 3 期,第 169-176 页。(2007)

摘要
丝氨酸蛋白酶在无脊椎动物宿主感染真菌的过程中起到重要作用。在以线虫(全齿复活线虫)为唯一氮源的洛里斯被毛孢 OWVT-1 的液体培养物中检测到胞外蛋白酶 (Hnsp),并通过硫酸铵沉淀、阴离子交换色谱法和凝胶过滤对胞外蛋白酶进行纯化。其分子量约为 32 kDa,最佳反应 pH 值和温度分别为 pH 7 和 40°C。在 pH 值为 6-8 时,Hnsp 活性稳定,在 50°C 时大幅下降 10 分钟。Hnsp 对 PMSF 抑制剂高度敏感,并且能够充分分解底物 N-琥珀酰-丙酰胺-丙酰胺-脯酰胺-苯丙氨酸对硝基酰苯胺,这表示其属于丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶/枯草杆菌蛋白酶。Hnsp 的 N 端氨基酸序列是 SVTDQQGADCGLARISHRE,这表示与来自食线虫真菌的其他丝氨酸蛋白酶具有较高的同源性。杀死线虫和在体外降解其角质层的能力表明 Hnsp 可能与线虫感染有关。© 2007 Springer.

 

Langston, J.、Blinkovsky, A.、Byun, T.、Terribilini, M.、Ransbarger, D.、Xu, F.
“链霉菌转谷氨酰胺酶的底物特异性”
《应用生物化学和生物科技 (Applied Biochemistry and Biotechnology)》,第 136 卷第 3 期,第 291-308 页。(2007)

摘要​
转谷氨酰胺酶 (TGase) 是一种多功能酶,对许多生理过程至关重要,如细胞分化、生物组织再生和植物病原性。酶的酰基转移功能可激活伯胺,从而将其附加到肽酰谷氨酰胺,该反应对于各种体内和体外蛋白质交联与修饰过程非常重要。为了更好地了解酶的结构与功能关系,并且为了进一步开发酶以作为工业生物催化剂,我们研究了多个链霉菌种和恶疫霉菌分泌的 TGase。我们从利迪链霉菌、平板链霉菌、黑色链霉菌、肉桂链霉菌和八丈岛链霉菌中对酶进行分离纯化。确定了利迪链霉菌、平板链霉菌和黑色链霉菌 TGase 的 pH 值与温度曲线。对利迪链霉菌 TGase 对其可接受酰基的胺底物的特异性进行了表征。底物的电子和空间特性与其反应性的相互关联证实了之前针对茂源链霉菌 TGase 提出的机制。© 2007 Humana Press Inc. 版权所有。保留任何性质的所有权利。

 

Sørensen, H.R.、Jørgensen, C.T.、Hansen, C.H.、Jørgensen, C.I.、Pedersen, S.、Meyer, A.S.
“来自特异腐质霉的新型 GH43 α-L-阿拉伯呋喃糖酶:作用方式以及与小麦阿拉伯木聚糖上的 GH51 α-L-阿拉伯呋喃糖酶的协同作用”
《应用微生物学和生物科技 (Applied Microbiology and Biotechnology)》,第 73 卷第 4 期,第 850-861 页。(2006)

摘要
属于糖苷水解酶 (GH) 家族 43 的新型 α-l-阿拉伯呋喃糖酶 (α-AraF) 从特异腐质霉中克隆,并在米曲霉中表达。1H-NMR 分析表明,在阿拉伯木聚糖及从阿拉伯木聚糖中衍生的低聚糖中,新型 GH43 酶选择性地对双重替代木吡喃糖基残留物的 (1→3)-α-l-阿拉伯呋喃糖基残留物进行水解。克隆酶的活性在 pH 值为 6.7 且温度为 53°C 时最佳。另外两种新型 α-l-阿拉伯呋喃糖酶 (α-AraF) 均属于 GH 家族 51,从特异腐质霉和白腐担子菌大型亚灰树花菌中克隆。在阿拉伯木聚糖中,这两种 GH51 酶可从单一替代木吡喃糖基中催化 (1→2) 和 (1→3)-α-l-阿拉伯呋喃糖基残留物的清除;通过使用大型亚灰树花菌酶可获得最高阿拉伯糖产量。在 pH 值为 6 且温度为 40°C 的条件下,如果将来自特异腐质霉的 GH43 α-AraF 与来自大型亚灰树花菌或特异腐质霉的 GH51 α-AraF 相结合 (50:50),在延伸反应中,水溶性小麦阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖释放将协同增加。当来自双歧杆菌种的 GH43 α-AraF 与任何一种 GH51 酶相结合时,GH43 与 GH51 α-AraF 之间的这种协同相互作用也非常明显。据推测,该协同效应是 GH51 α-AraF 的结果,该酶能够催化单一位置 (1→2)-α-l-阿拉伯呋喃糖基的清除,在此之前,GH43 酶催化清除了小麦阿拉伯木聚糖中双重替代木吡喃糖基上的 (1→3)-α-l-阿拉伯呋喃糖基残留物。© 2006 Springer-Verlag.

 

Rasmussen, L.E.、Sørensen, H.R.、Vind, J.、Viksø-Nielsen, A.
“来自埃默森篮状菌和里氏木霉的 β-木糖苷酶的作用方式与特性”
《生物科技与生物工程 (Biotechnology and Bioengineering)》,第 94 卷第 5 期,第 869-876 页。(2006)

摘要
要利用半纤维素进行乙醇发酵,或者要通过已生成木糖的催化氢化作用制造低卡路里甜味剂木糖醇,阿拉伯木聚糖的酶法水解是重要的前提条件。本研究侧重于来自埃默森篮状菌 (βXTE) 和里氏木霉 (βXTR) 的两种工业相关 β-木糖苷酶(1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、EC 3.2.1.37)的克隆与表征分析,并使用工业相关底物比较其与半纤维素水解的关系。两种 β-木糖苷酶均在米曲霉中表达并随后纯化。在木二糖的酶水解过程中,发现两种酶的反应产物都是 β-D-木糖,证明水解是通过保留反应机制进行的。基于序列相似性和糖基水解酶家族成员,预测 βXTE 和 βXTR 的活性位点残基分别是 Asp 242 和 Glu 441,以及 Asp 264 和 Glu 464。通过使用导致两种酶完全失活的碳化二亚胺-亲核试剂程序进行修饰来检查这些羧基的催化作用。乙醇发酵副产物酒糟中 βXTE 和 βXTR 释放木糖的程度分别为 12.1% 和 7.7%。使用 β-木糖苷酶与多组分酶产品 Ultraflo L 组合,分别使木糖释放 41.9% 和 40.8%,分别表明在 Ultraflo L 中,外切型 β-木糖苷酶和内切-1,4-β-木聚糖酶及 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶之间有很强的协同作用。尽管在比活性和动力学特性方面存在差异,但在用于该特定应用时,两种 β-木糖苷酶似乎没有可测量的差异。© 2006 Wiley Periodicals, Inc.

 

Thiemann, V.、Saake, B.、Vollstedt, A.、Schäfer, T.、Puls, J.、Bertoldo, C.、Freudl, R.、Antranikian, G.
“嗜热厌氧菌 Anaerobranca gottschalkii 中一种新型分支酶的异源表达和表征”
《应用微生物学与生物科技 (Applied Microbiology and Biotechnology)》,第 72 卷第 1 期,第 60-71 页。(2006)

摘要
编码来自嗜热厌氧菌 Anaerobranca gottschalkii 的分支酶 (BE) 的基因,与来自大肠杆菌的双精氨酸易位蛋白分泌途径依赖性信号序列融合并在葡萄球菌中表达。使用疏水相互作用和凝胶过滤色谱纯化分泌的 BE。单体酶 (72 kDa) 在 50°C 和 pH 7.0 时显示最大活性。利用直链淀粉 BE 显示较高转糖基作用和极低的水解活性。通过应用高效阴离子交换色谱和定量尺寸排阻色谱,分析直链淀粉和线性糊精的转化。直链淀粉 (104-4×107 g/mol) 主要转化为分子量为 10 4-4×105 g/mol 的产物,表明该酶可适用于生产具有窄分子量分布的淀粉或糊精。在新合成的 α-1,6 连锁的酶水解之后测定的大部分转移的寡糖介于 103 和 104 g/mol之间,这相当于聚合度 (DP) 6-60。最小的供体链长度为 DP 16。此外,获得的结果支持 BE 的随机内切裂机理和链间分支发生的假设。© Springer-Verlag 2006。

 

Langston, J.、Sheehy, N.、Xu, F.
“米曲霉家族 3 β-葡糖苷酶的底物特异性”
《生物物理学报 - 蛋白质与蛋白质组学 (Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics)》,第 1764 卷第 5 期,第 972-978 页。(2006)

摘要
在糖苷水解酶中,β-葡糖苷酶在许多生理和生物催化过程中发挥独特作用,这些过程涉及各种寡糖或糖苷的 β-连接 O-糖基键。在结构上,该酶可以分为糖苷水解酶家族 1 和 3。虽然已经确立家族 3 β-葡糖苷酶催化的基本(“保留,双位移”)机制,但是对其结构功能关系的深度理解仍然有限,特别是对于开发作为多功能生物催化剂的酶非常重要的底物特异性。为了进一步探测活性位点,我们对具有底物和不同结构的竞争性抑制剂的米曲霉中家族 3 β-葡糖苷酶进行了比较研究,试图评价吡喃糖基底物与酶之间的位点特异性空间和化学相互作用。我们的研究结果显示该酶对其“- 1”活性亚位点具有严格的立体化学要求(以适应 β-d-吡喃葡萄糖),与其家族 1 相反。© 2006 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Viksø-Nielsen, A.、Andersen, C.、Hoff, T.、Pedersen, S.
“用于生淀粉水解的新型 α-淀粉酶的开发”
《生物催化与生物转化 (Biocatalysis and Biotransformation)》,第 24 卷第 1-2 期,第 121-127 页。(2006)

摘要
本文描述了发现杆菌属污染物中新的 4 结构域 α-淀粉酶,其可非常高效地水解生淀粉颗粒。与传统淀粉液化 α-淀粉酶相比,这种新的 4 结构域 α-淀粉酶含有淀粉结合结构域。这种淀粉结合结构域的存在使酶能够在低于胶凝化温度的温度下高效地水解淀粉。在 60°C 的反应温度下并与黑曲霉的葡糖淀粉酶结合,可以液化 99% 的淀粉,得到 95% 的 DX 值。此外,我们描述了如何使用这种新的 4 结构域 α-淀粉酶与葡糖淀粉酶结合,将当前的 HFCS 工艺转化为低温同时液化和糖化工艺。© 2006 Taylor & Francis。

 

Yang, J.、Huang, X.、Tian, B.、Sun, H.、Duan, J.、Wu, W.、Zhang, K.
“食线虫真菌刀孢轮枝菌的细胞外丝氨酸蛋白酶基因的表征”
《生物科技通信 (Biotechnology Letters)》,第 27 卷第 17 期,第 1329-1334 页。(2005)

摘要
通过 3' 和 5' RACE(cDNA 末端快速扩增)方法,从三个分离的刀孢轮枝菌 (syn. Verticillium psalliotae) 克隆了编码表皮降解丝氨酸蛋白酶的基因。该基因编码 382 个氨基酸,蛋白质与枯草杆菌蛋白酶 N 和肽酶 S8 共享保守基序。比较三种分离株的翻译后 cDNA 序列,发现 230 位有一个氨基酸多态性。推测的蛋白酶序列与其他食线虫真菌的其他表皮降解蛋白酶具有高度相似性。© Springer 2005。

 

Bermek, H.、Yazici, H.、Öztürk, H.、Tamerler, C.、Jung, H.、Li, K.、Brown, K.M.、Ding, H.、Xu, F.“木材降解真菌红色毛癣菌 LSK-27 的锰过氧化物酶的纯化与表征
《酶与微生物科技 (Enzyme and Microbial Technology)》,第 35 卷第 1 期,第 87-92 页。(2004)

摘要
通过阴离子交换色谱法,然后进行凝胶过滤,将来自木材降解真菌红色发癣菌 LSK-27 的锰过氧化物酶 (MnP) 纯化至均质。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳疗法 (SDS-PAGE) 测定纯化酶的分子量为约 42 kDa。酶的分光光度分析显示在 407 nm 处有一个 Soret 最大值,在 502 和 644 nm 处有两个可见峰,这与其他 MnP 的光度谱相一致。消化蛋白的质谱分析表明,它与来自烟管菌属 B33/3 的独特过氧化物酶(MnP 和木质素过氧化物酶的杂合体)具有非常高的同源性。烟管霉属 MnP 能够氧化藜芦醇,而红色发癣菌 LSK-27 MnP 则不能。目前已报告的 MnPs 中,红色发癣菌 LSK-27 MnP 的 pI 最高,为 8.2。该酶在相当高的温度下是稳定的,并且当与其他 MnP 相比时,该 MnP 在存在高浓度 H2O2 的情况下更稳定。© 2004 Elsevier Inc. 保留所有权利。

 

Bertoldo, C.、Armbrecht, M.、Becker, F.、Schäfer, T.、Antranikian, G.、Liebl, W.
“来自 Anaerobranca gottschalkii 的热碱稳定性 I 型普鲁兰酶的克隆、测序和表征”
《应用与环境微生物学 (Applied and Environmental Microbiology)》,第 70 卷第 6 期,第 3407-3416 页。(2004)

摘要
编码 I 型普鲁兰酶的基因是从厌氧噬碱细菌 Anaerobranca gottschalkii 基因组序列中鉴定出来的。另外,同源基因从贺利厌氧分支状菌的基因文库中分离并测序。这两个基因编码的蛋白质与来自嗜热厌氧细菌 Fervidobacterium pennivorans 和海栖热袍菌的普鲁兰酶具有 39% 的氨基酸序列同一性。将来自 A. gottschalkii 的普鲁兰酶基因(编码 865 个氨基酸,预测分子量为 98 kDa)在大肠杆菌 BL21(DE3) 中克隆并表达,使得该蛋白质不具有信号肽。因此,纯化的重组普鲁兰酶 (rPulAg) 的分子量为 96 kDa。普鲁兰多糖水解活性在 pH 8.0 和 70°C 下是最佳的,在这些物化条件下,rPulAg 的半衰期为 22 小时。通过在大肠杆菌 Tuner(DE3)(pLysS) 中使用替代表达策略,克隆来自 A. gottschalkii 的普鲁兰酶基因,包括其信号肽编码序列。在这种情况下,纯化的重组酶是截短的 70-kDa 形式 (rPulAg′)。研究发现纯化的 rPulAg' 的 N-末端序列在起始位点下游 252 个氨基酸处,可能表明大肠杆菌存在可选的翻译起始或 N-末端蛋白酶裂解。有趣的是,rPulAg' 的大部分物化性质与 rPulAg 相同。两种酶均通过内切型机制降解普鲁兰多糖,产生麦芽三糖作为最终产物,并且还利用支链淀粉、淀粉、β-限制性糊精和糖原检测到水解活性,而利用直链淀粉不能检测到。这种底物特异性是 I 型普鲁兰酶的典型特征。rPulAg 受到环糊精抑制,而加入单价或二价阳离子没有刺激作用。另外,存在 0.5% 十二烷基硫酸钠、20% 吐温和 50% 曲拉通 X-100 的情况下,rPulAg' 是稳定的。A. gottschalkii 的普鲁兰酶是已经描述的第一个热碱稳定性 I 型普鲁兰酶。

 

M.L.Shinohara;M.Ihara;M.Abo;M.Hashida;S.Takagi;T.C.Beck。
“一种来自极端嗜热细菌种群 Rhodothermus obamensis 的新型热稳定分支酶”
《应用微生物学与生物科技 (Appl Microbiol Biotechnology)》,第 57 卷,653-659 (2001)

摘要

从极嗜热细菌 Rhodothermus obamensis 分离分支酶 (EC 2.4.1.18) 基因。预测的蛋白质编码 621 个氨基酸的多肽,预测分子量为 72 kDa。推导的氨基酸序列与已知的细菌分支酶序列具有 42-50% 的相似性。与芽孢杆菌分支酶类似,预测的蛋白质具有比大肠杆菌分支酶更短的 N-末端氨基酸延伸。 推导的氨基酸序列似乎不含信号序列,表明它是一种胞内酶。 R. obamensis 分支酶在大肠杆菌和丝状真菌米曲霉中成功表达。 该酶在 pH 6.0 - 6.5 和 65 °C 时显示出最佳催化活性。 该酶在 80 °C 下存放 30 分钟后稳定,在 80 °C 下存放 16 小时后保持 50 % 的活性。 针对直链淀粉,酶的分支活性高于对支链淀粉的支化活性。 这是从极端嗜热菌中分离出来的第一个热稳定分支酶。


F. Xu;E.J.Golightly;C.C.Fuglsang;P. Schneider P, K.R.Duke.L. Lam;S. Christensen;K.M.Brown;C.T.Jorgensen;S.H.Brown。
“一种新型碳水化合物:来自雪霉微座孢的受体氧化还原酶”
《欧洲生物化学杂志 (Eur. J. Biochem.)》,第 268 卷,1136-1142 (2001)
 
摘要

雪霉微座孢碳水化合物:受体氧化还原酶被纯化、克隆、异源表达和表征。编码蛋白质的基因显示出一个内含子,并且 ORF 显示与其他已知的含有黄素的碳水化合物氧化酶具有低同源性(小于或等于 25% 同一性或 65% 相似性)的序列。除了 18 个氨基酸的信号肽之外,蛋白质成熟需要裂解四聚体前肽。研究发现酶的相对分子量为 55000 Da,等电点为 9,每个蛋白质有一个 FAD。它可以氧化单糖、寡糖或聚合糖,并将其电子转移到 O-2 或其他接受者。当 D-葡萄糖用作供电子底物时,在 pH 5.5 和 23 摄氏度下观察到 2 s(-1) 的活性。在各种寡糖中,酶优选四聚体糊精,表明四个连接的葡萄糖单元与底物口袋存在有利的相互作用。氧化寡糖/聚合糖的独特结构和能力表明,该酶用于各种工业/药物应用的前景广阔。
 
 
F. Xu;E.J.Golightly;P. Schneider;R.M.Berka;K.M.Brown;J.A.Johnstone;D.H. Baker;C.C.Fuglsang;S.H.Brown;A.V.Klotz。
“重组镰孢属半乳糖氧化酶的表达和表征。”
《应用生物化学与生物技术 (Appl.Biochem.Biotechnol.)》 第 88 卷,23-32 (2000)

摘要

镰孢属(树状指孢霉)半乳糖氧化酶在米曲霉和镰孢霉宿主中表达。 在黑曲霉 á-淀粉酶或镰刀菌胰蛋白酶启动子的控制下,达到高水平的半乳糖氧化酶表达。 对在米曲霉宿主中表达的重组氧化酶进行纯化和表征。 纯化的酶在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳疗法 (SDS-PAGE) 上具有 66 kDa 的分子量,并且每摩尔蛋白质具有 0.4 mol 铜原子。 铜饱和后,化学计量增加至 1.2。 基于过氧化物酶偶联试验,该酶制剂在 pH 7 和 20°C 下显示每秒钟向 D-半乳糖 (0.1 M) 转化 440 次的活性。 该酶在 pH 6.0 的条件下最佳温度为 60°C,无活化吉布斯能 33 kJ/mol。 测试了一系列 D-半乳糖衍生物作为氧化酶的还原底物。 活性差异被解释为氧化酶对吡喃糖底物中取代基的立体定向性,特别是在 C5 和环状半缩醛 O 位点上。 重组氧化酶可以作用于一些含有半乳糖的多糖,如瓜尔豆胶,但不能氧化几种常见的缺少伯醇官能团的氧化还原化合物。

 

R.M.Berka;P. Schneider;E.J.Golightly;S.H.Brown;M. Madden, K.M.Brown;T. Halkier;K. Mondorf;F. Xu。
“编码嗜热毁丝霉细胞外漆酶的基因的表征和米曲霉产生的重组酶的分析”
《应用与环境微生物学 (Appl.Environ.Microbiol.)》第 63 卷,3151-3157 (1997)

摘要

从嗜热真菌嗜热毁丝霉中分离编码细胞外漆酶的基因组 DNA 片段,并测定该基因的核苷酸序列。嗜热毁丝霉漆酶 (MtL) 的推导的氨基酸序列显示了不同真菌属的漆酶的同源性。在米曲霉 α-淀粉酶基因启动子和终止子的转录控制下,构建了含有嗜热毁丝霉漆酶编码区的载体,用于在米曲霉中异源表达。将在米曲霉中表达的重组漆酶通过阴离子交换色谱纯化至电泳均一性。氨基末端序列数据表明 MtL 作为前酶原合成。通过在聚丙烯酰胺葡聚糖 S-300 上的凝胶过滤,估计分子量约为 100-140 kDa,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳疗法估计为 85 kDa。碳水化合物分析显示,MtL 含有 40 至 60% 的糖基化。漆酶显示蓝色铜氧化酶的典型吸收光谱,最大值在 276 和 589 nm,每个亚基含有 3.9 个铜原子。以丁香醛连氮作为底物,MtL 在 pH 6.5 时具有最佳活性,并且在 60 摄氏度下孵育 20 分钟时保留近 100% 活性。这是耐热漆酶克隆和异源表达的首份报告。