Jacobsen, J.、Lydolph, M.、Lange, L.
“独立于培养物的 PCR:另一种酶的发现策略”
(2005)《微生物学方法杂志 (Journal of Microbiological Methods)》,第 60 卷第 1 期,第 63-71 页。

摘要
简并引物被设计用于对来自栖息于玉米秸秆和叶子残留物的复合真菌群落的 DNA 进行独立于培养物的 PCR 筛选。根据相似性搜索和比对,扩增了与糖基水解酶家族 7 和糖基水解酶家族 45 相关的克隆序列,但观察到显著的序列差异。来自 7 族和 45 族的糖基水解酶在生物质向燃料乙醇的转化中起着至关重要的作用。对这种可再生能源的研究有两个目的:(i) 为有限的全球原油储量发展一种可再生替代品和 (ii) 为减少空气污染做出贡献。使用 18S rDNA 特异性引物进行扩增后,发现这些群落中存在子囊菌纲粪壳菌目和肉座菌目以及担子菌纲伞菌目。我们的研究证明了培养物非依赖性 PCR 在微生物多样性研究中的价值,并且可以促进开发新的酶筛选技术。© 2004 Elsevier B.V. 保留所有权利。 


Becker, F.、Schnorr, K.、Wilting, R.、Tolstrup, N.、Bendtsen, J.D.、Olsen, P.B.
“体外转座子辅助信号序列捕获技术的发展及其在嗜碱芽孢杆菌 C125 和硫磺矿硫化叶菌 P2 基因文库筛选中的应用”
(2004) 《微生物学方法杂志 (Journal of Microbiological Methods)》,第 57 卷第 1 期,第 123-133 页。

摘要
为了鉴定编码胞外蛋白的基因,构建了含有无信号 β-内酰胺酶 (′bla) 作为报告基因的小转座子 TnSig,并用于在大肠杆菌中制备的基因组文库的体外转座。'bla 基因被克隆到一个能够在 'bla 与靶基因之间进行翻译融合的噬菌体 Mu 小转座子中。TnSig 在正确阅读框中与携带跨膜结构域或信号肽的蛋白质融合导致了相应克隆的氨苄青霉素抗性。使用 TnSig 标记来自嗜碱细菌嗜碱芽孢杆菌 C125 和极端嗜热古细菌硫磺矿硫化叶菌 P2 的原核基因文库。使用公开可用的基因组序列(EMBL BA000004 和 EMBL AE006641)进行蛋白质在细胞中定位的快速开放阅读框 (ORF) 鉴定和预测。利用该方法成功鉴定出分泌蛋白、跨膜蛋白和脂蛋白的基因。与以前基于转座子的鉴定策略相比,本文描述的方法是快速和多功能的,并且本质上支持对任何可选择的标记物兼容文库进行标记。它适用于在广泛的原核生物基因文库中鉴定编码胞外蛋白的基因。© 2004 Elsevier B.V. 保留所有权利。


W. Helbert、H. Chanzy、T.L.Husum、M. Schülein、S. Ernst。
“荧光纤维素微原纤维作为检测纤维素酶活性的底物”
《生物大分子 (Biomacromolecules)》,第 4 卷,第 481-487 页 (2003)

摘要
为了设计出一种基于具有天然纤维素大部分物理特性的底物的敏感性纤维素酶测定方法,使用 5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素 (DTAF) 作为接枝剂制备来自细菌纤维素的荧光微原纤维的悬浮液。利用一系列来自特异腐质霉来源的商业相关纤维素酶(克隆的 Cel6B 和 Cel45A)以及粗制的特异腐质霉复合物对这些悬浮液进行了消化。这种消化诱导了荧光纤维糊精以及还原糖的释放。充分离心后,通过接枝含量、消化时间和纤维素酶特征对这些可溶性产物进行了分析。得到的数据使接枝条件得以优化,最大限度提高了可溶性产物的数量,从而提高了检测的灵敏度。对释放的荧光量与释放的还原糖量之间的比较允许区分进行性纤维素外切酶和内切酶活性。 微孔滴定板底部处 DTAF 接枝微原纤维膜的铸型也导致了对纤维素酶的敏感检测。由于这些薄膜在消化过程中保持完整并始终牢固地粘在孔底,因此它们可以被定制用于纤维素酶的全自动化测试。


V. Boyer、S. Fort、T.P.Frandsen、M. Schulein、S. Cottaz、H. Driguez。
“双功能化纤维六糖苷作为纤维素酶荧光猝灭敏感性测定的特异底物的化学酶法合成”
《欧洲化学杂志 (Chemistry-a European Journal)》,第 8 卷第 6 期,第 1389-1394 页 (2002)

摘要
合成一种新的双功能化纤维六糖衍生物作为通过共振能量转移连续测定纤维素酶的特异底物。这种纤维六糖苷在还原端具有作为荧光能量供体的萘基 (EDANS) ,在非还原端具有作为受体发色团的 4-(4'-二甲基氨基苯偶氮)-苯衍生物。制备靶分子的关键步骤是纤维二糖基和纤维四糖基氟供体与纤维二糖基受体的转糖基反应,由来自特异腐质霉的纤维素酶 Cel7B 的 E197A 突变体进行催化。使用各种纤维素酶消化后,能量转移被破坏,观察到荧光增加。


S.F.Lassen、J. Breinholt、P.R.Østergaard、R. Brugger、A. Bischoff、M. Wyss、C.C.Fuglsang.
“来自四种担子菌(隔孢伏革菌、平田头菇、蜡质菌属、绒毛栓菌)的五种新型植酸酶的表达、基因克隆和表征”
《应用与环境微生物学 (Appl. Environ. Microbiol.)》,第 67 卷,第 4701-4707 页 (2001)

摘要
植酸酶能够催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)的磷酸单酯键的水解,从而产生较低形式的肌醇磷酸盐和无机磷酸盐。在本研究中,构建四种担子菌(隔孢伏革菌、平田头菇、蜡质菌属、绒毛栓菌)的 cDNA 表达文库,并在酵母中筛选了植酸酶活性。从每个文库中分离出一个编码全长植酸酶的 cDNA,蜡质菌属除外,在其中发现了编码植酸酶的两种不同 cDNA。所有五种植酸酶均在米曲霉中进行了表达、纯化和表征。植酸酶显示最适温度在摄氏 40 和 60 度之间,最佳 pH 为 5.0 至 6.0,隔孢伏革菌植酸酶除外,其最佳 pH 为 4.0 至 5.0。它们在 400 至 1, 200 U/mg 蛋白质(-1) 范围内展现出特异性活性,并且能够将植酸盐水解成肌醇单磷酸酯。令人惊讶的是,对所有五种担子菌植酸酶的植酸盐水解过程进行的 H-1 核磁共振分析显示优先对植酸的 6-磷酸基团进行初始攻击,而过去尚未在真菌植酸酶中观察到过这一特征。因此,本文所述的担子菌植酸酶应被归为 6-植酸酶 (EC 3.1.3.26)。


M. Skjøt、S. Kauppinen、L.V.Kofod、C.C.Fuglsang、M. Pauly、H. Dalbøge、L.N.Andersen。
“来自棘孢曲霉的阿拉伯聚糖内切酶的功能克隆及其在米曲霉和烟草中的异源表达”
《分子遗传学与基因组学 (Mol. Genet. Genomics.)》,第 265 卷,第 913-921 页 (2001)

摘要
在酵母中的功能性克隆已被用于从丝状真菌棘孢曲霉分离编码 α-1,5-L-阿拉伯聚糖内切酶的全长 cDNA。通过在酵母表达载体中构建的 cDNA 文库中对水解 AZCL-阿拉伯聚糖的转化子进行筛选,鉴定出全部具有相同阿拉伯聚糖酶编码 cDNA 的 44 种酿酒酵母克隆。在米曲霉中表达克隆出的 cDNA,并对重组酶进行了纯化和表征。通过分析对脱支阿拉伯聚糖的消化模式来研究该酶的作用模式。获得的消化曲线强烈表明该酶是阿拉伯聚糖内切酶。另外,研究了使用烟草作为表达阿拉伯聚糖酶的替代宿主的可行性。


M. Pauly、L.N.Andersen、S. Kauppinen、L.V.Kofod、W.S.York、P. Albersheim、A. Darvill.
“来自棘孢曲霉的木葡聚糖特异性 β-1,4-葡聚糖内切酶:在酵母中的表达克隆以及重组酶的纯化和表征”
《糖生物学 (Glycobiology)》,第 9 卷第 1 期,第 93-100 页 (1999)

摘要
通过在酵母中的表达克隆从丝状真菌棘孢曲霉中分离出编码木葡聚糖特异性 β-1,4-葡聚糖内切酶 (XEG) 的全长 c-DNA。在含天青蛋白染色的交联木葡聚糖的琼脂平板上鉴定出表达功能性 XEG 的克隆。对编码 XEG 的 cDNA 进行了分离、测序并克隆到曲霉表达载体中,然后转化到米曲霉中进行异源表达。通过阴离子交换和凝胶渗透色谱法将重组酶纯化至明显的均一性。重组 XEG 的分子量为 23,600,等电点为 3.4,在 pH 为 3.4 和温度低于 30℃ 时最为稳定。该酶能够水解来自各种来源的结构不同的木葡聚糖,但不能水解其他细胞壁成分,因此可被认为是木葡聚糖特异性 β-1,4-葡聚糖水解内切酶。XEG 能够水解其底物并保留端基构型。重组酶的 Km 为 3.6 mg/ml,比活性为 260 微摩尔/分钟/毫克蛋白质。对该酶水解植物细胞壁木葡聚糖寡糖的能力进行了测试。结果表明,应用 XEG 处理植物细胞壁只产生木葡聚糖寡糖,表明该酶可以成为木葡聚糖结构解析的有力工具。