Micheelsen, P.O.、Østergaard, P.R.、Lange, L.、Skjøt, M.
“天然大麦 α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂在巴斯德毕赤酵母中的高水平表达”
《生物技术杂志 (Journal of Biotechnology)》,第 133 卷第 4 期,第 424-432 页。(2008)

摘要

已经在巴斯德毕赤酵母中使用甲醇诱导型醇氧化酶 1 (AOX1) 启动子开发了用于高水平表达本地大麦 α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂 (BASI) 的表达系统。为了优化表达,设计了两个密码子优化的编码区,并与野生型编码区一起表达。为确保天然成熟蛋白的分泌,使用来自酿酒酵母的 α-交配因子分泌信号的截短版本。为了能够比较来自不同克隆的表达水平,通过 PCR 筛选选择通过 AOX1 基因的基因置换产生的单一插入转化体。在甲醇诱导后,野生型编码区的表达水平达到 125 mg L-1,而两个密码子优化变体的表达分别达到 65 和 125 mg L-1。通过埃德曼降解、液相色谱质谱和不溶性蓝色淀粉试验,该蛋白质被纯化和表征,显示具有与从大麦颗粒纯化的野生型蛋白质相同的特征。© 2007 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Hamann, T.、Lange, L.
“发现、克隆和异源表达分泌的马铃薯蛋白质显示在米曲霉中错误的前 mRNA 剪接”
《生物技术杂志 (Journal of Biotechnology)》,第 126 卷第 3 期,第 265-276 页。(2006)

摘要

一种新型转位子辅助信号捕获 (TAST) 技术,开发用于专门选择分泌的蛋白质,用来发现致病疫霉感染的马铃薯的新型细胞外植物蛋白质。384 次 hits 分析提供了 191 致病疫霉和马铃薯序列的分泌蛋白,其中约 2/3 来自马铃薯。随后使用生物信息学筛选相关的基因。显示了选定的多种发现序列,包括新型马铃薯木葡聚糖内转葡糖基酶 (StXTH),其被克隆并在米曲霉中受到了详细的异源表达研究。来自米曲霉 StXTH1 转化体的 mRNA 的 RT-PCR 分析显示,已经错误处理了部分 mRNA 库,并且仅可检测到弱的和不一致的活性蛋白质指示。StXTH1 的高 AT 含量和米曲霉内含子供体、受体和分支点识别位点的出现导致 mRNA 编码序列部分出现错误的内含子解读(隐含内含子)。这可以解释在丝状真菌中表达植物基因时经常遇到的困难。© 2006 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Herzberg, K.、Bashkirov, V.I.、Rolfsmeier, M.、Haghnazari, E.、McDonald, W.H.、Anderson, S.、Bashkirova, E.V.、Yates III, J.R.、Heyer, W.-D.
“在丝氨酸 2、8 和 14 上的 Rad 55 的磷酸化对于停滞复制叉恢复中的高效同源重组是必要的条件”
《分子细胞生物学 (Molecular and Cellular Biology)》,第 26 卷第 22 期,第 8396-8409 页。(2006)

摘要

DNA 损伤检查点协调细胞对基因毒性应激的反应,并停止响应 DNA 损伤和复制叉停滞的细胞周期。同源重组是修复 DNA 双链断裂和其他检查点诱导损伤的普遍途径。此外,同源重组涉及 DNA 损伤的复制后耐受性和复制叉停滞后 DNA 复制的恢复。在本文中,我们显示对于存活以及在全基因组遗传毒性应激下的正常生长,特别需要 Rad 55 蛋白的丝氨酸 2、8 和 14 (S2,8,14) 上的磷酸化。Rad 55 是酿酒酵母中的 Rad 51 旁系同源物,在组装 Rad 51 丝时发挥作用,Rad 51 丝是重组 DNA 修复的中心中间体。在 DNA 损伤条件下,磷酸化缺陷的 rad 55-S2,8,14A 突变体在 S 期显示非常缓慢的遍历,这可能是由于复制叉停滞的恢复较慢或复制相关 DNA 损伤的修复较慢。这些结果表明 Rad 55-S2,8,14 磷酸化激活重组修复,允许在遗传毒性应激之后较快速恢复。© 2006 美国微生物学会版权所有。保留所有权利。

 

Brinch-Pedersen, H.、Hatzack, F.、Stöger, E.、Arcalis, E.、Pontopidan, K.、Holm, P.B.
“转基因小麦中的热稳定植酸酶:沉积模式、热稳定性和植酸水解”
《农业与食品化学杂志 (Journal of Agricultural and Food Chemistry)》,2006 年,第 54 卷第 13期,第 4624-4632 页。

摘要

本文以植酸酶为模型,阐述了植物合成异源酶的耐热性问题。对两种转基因小麦材料进行了评估,一种表达具有低变性温度 (62.5℃) 但具有高重折叠能力的烟曲霉植酸酶,另一种表达被改造为高变性温度 (89.3℃) 的合理设计共变植酸酶。小麦高分子量麦谷蛋白 1DX5 启动子保证了高水平的胚乳特异性表达。在光学和电子显微镜水平进行的免疫检测明确显示异源植酸酶沉积在液泡中,尽管转化构建体被设计用于分泌至质外体。热稳定性和动力学特性评估表明,在这些沉积条件下,基于高解折叠温度的热稳定性优于高重折叠能力,这代表了提高谷物饲料和食品中磷酸盐和矿物质生物利用度的一种现实策略。© 2006 美国化学学会。

 

C. Muller;C. M. Hjort;K. Hansen;J. Nielsen。
“改变两种几丁质合酶基因的表达会对米曲霉的生长和形态造成不同的影响。”​
《微生物学 (Microbiology)》(雷丁),2002 年,第 148 卷第 12 期,第 4025-4033 页。

摘要

在米曲霉中,对一种全长几丁质合酶 (chsB) 和另外两种几丁质合酶(csmA 和 chsC)的片段进行了鉴定。chsB 的推导氨基酸序列与来自构巢曲霉的 chsB(其编码 III 类几丁质合酶)相似,具有 87% 的一致性。对 csmA 获得的序列表明它与 V 类几丁质合酶具有高度相似性。使用亚硝酸盐还原酶 (niiA) 启动子构建 chsB 和 csmA 基因缺失菌株以及 chsB 转录受控的菌株。在菌丝生长期间通过 Northern 分析检查菌株,并且在存在钙荧光白 (CFW) 的情况下分析细胞壁构成和生长情况。ChsB 基因缺失菌株和未诱导的 p(niiA)-chsB 菌株表现为高度分枝形成,它们具有比野生型菌株更低的产孢量,并且对 50 mg l(-1) 浓度的 CFW 敏感。当在含有 p(niiA)-chsB 构建体的菌株中诱导 chsB 转录时,该菌株在固体培养基上表现为野生型形态并处于次最大生长速率,但这种野生型形态在分批培养中的快速生长期间没有完全恢复。csmA 基因缺失菌株表现出形态异常,例如气球样细胞、菌丝内菌丝和分生孢子疤痕。当存在 10 mg l(-1) 浓度的 CFW 时,生长受到严重抑制。在所有构建的菌株中,细胞壁构成与野生型都没有差异。Northern 分析表明,当 chsB 表达改变时,几丁质合酶基因 csmA 和 chsC 的转录没有变化;当 csmA 基因被破坏时,chsB 和 chsC 的转录也没有变化。

 

H. Pedersen;B. Christensen;C. Hjort;J. Nielsen。
“不产草酸黑曲霉菌株的构建与鉴定。”
《代谢工程 (Metab Eng)》,2000 年,第 2 卷第 1 期,第 34-41 页。

摘要

黑曲霉会产生草酸作为副产物,这在工业酶的下游加工中会引起问题。为了克服这个问题,在产葡糖淀粉酶的黑曲霉菌株中破坏编码草酰乙酸水解酶 (EC 3.7.1.1) 的 oah 基因,得到不能产生草酸的菌株。对这种基因缺失型菌株与分批培养中的产草酸野生型菌株进行了比较。两种株菌的比生长速率为 0.20 h(-1)。柠檬酸产量是相同的,但基因缺失型菌株的葡糖淀粉酶产量仅为野生型菌株的 50%。使用 13C 标记的葡萄糖作为底物进行批量实验以确定通过中心代谢的代谢通量。两种菌株的代谢通量几乎相同,提示有可能破坏 oah 基因而不造成多效性后果。两种菌株通过戊糖磷酸途径的通量均约为葡萄糖摄取量的 60%,这表明具有足够的 NADPH 供应量用于生物合成。

 

P.L.Jørgense n;M. Tangney;P.E.Pedersen;S. Hastrup;B. Diderichsen;S.T.Jørgensen。
“利用一种改良技术对迟缓芽孢杆菌进行碱性蛋白酶基因的克隆和测序以及染色体基因的扩增。”
《应用与环境微生物学 (Appl.Environ.Microbiol.)》2000 年,第 66 卷,第 825-827 页。

摘要

从嗜碱迟缓芽孢杆菌 NCIB 10309 中将编码碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶,商品名为 Savinase®)的基因克隆至迟缓芽孢杆菌 DN497 中,并测定其核苷酸序列。克隆的基因用于增加染色体上蛋白酶基因的拷贝数。从这些研究中,使用温度敏感性质粒 pE194 开发出一种改良的基因整合和扩增技术。

 

K. L. Petersen;J Lehmbeck;T. Christensen。
“曲霉淀粉酶基因的一种新型转录激活因子。”
《分子遗传学与基因组学 (Mol Gen Genet)》,1999 年,第 262 卷,第 668-676 页。

摘要

我们克隆出一种用于在米曲霉中进行淀粉酶合成的调控基因。该基因名为 amyR,编码一种具有 Cys6 锌簇结构域的 604 个氨基酸的转录激活因子,其与来自酿酒酵母的 GAL4 的 DNA 结合域显示出广泛的同源性。amyR 的 DNA 结合域与在编码淀粉降解酶的曲霉属基因的许多启动子中发现的两种序列结合。一种类型的结合位点的特征在于由八个核苷酸分隔开的两个 CGG 三联体。另一种类型只有一个 CGG 三联体,其后紧接着 AAATTTAA 序列。