Faber, C.、Hobley, T.J.、Mollerup, J.、Thomas, O.R.T.、Kaasgaard, S.G.
“影响盐敏芽孢杆菌 α-淀粉酶溶度的因素”
《化学工程和加工技术:过程强化 (Chemical Engineering and Processing: Process Intensification)》,第 47 卷第 6 期,第 1007-1017 页。(2008)

摘要

我们对重组芽孢杆菌 α-淀粉酶的溶度进行了详细研究。选择了来自大量结晶的半纯化制剂,其包含 6 个亚型,pI 值在 5.5 和 6.1 之间。溶度受到 pH 的强烈影响,与 pH 10 相比,在 pH 6 时可以降低大约 200 倍,在溶液中仅留下 0.1 mg/mL。使用盐也可以对溶度进行显着的操作。研究发现阴离子的选择比阳离子更重要,使用硫酸钠发现了最低的溶度。对于阴离子,溶度遵循 Hofmeister 序列预期的顺序,但是对于阳离子观察到更复杂的行为。除了锂以外,它们影响溶度的效率与预期相反。溶液的多分散性由于加入盐而降低,并且 ζ 电位测量表明锂引起 pI 的变化。我们对这些观察结果的可能解释进行了讨论,扩展了我们对盐影响蛋白质溶度方式的现有理解,迄今为止主要是基于溶菌酶实验。© 2007 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Sonesson, A.W.、Callisen, T.H.、Brismar, H.、Elofsson, U.M.
“采用双偏振干涉 (DPI) 和共聚焦显微镜测量疏水和亲水表面上疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的吸附和活性”
《胶体和表面 B:生物界面 (Colloids and Surfaces B: Biointerfaces)》,第 61 卷第 2 期,第 208-215 页。(2008)


摘要

采用双偏振干涉 (DPI) 以及疏水和亲水表面上共聚焦显微镜测量疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶 (TLL) 的吸附和活性。在吸附等温线中,与亲水表面 (1.40-1.50 mg/m2) 相比,显然 TLL 对疏水表面具有更高的亲和力并吸附到更高的吸附量 (1.90 mg/m2)。在吸附量 >1.0 mg/m2 时,两个表面上吸附层的厚度保持不变 (∼3.5 nm),而在较低表面覆盖率时,亲水表面的吸附层厚度减小,这可能是 TLL 结构部分展开所致。然而,吸附层的折射率对 C18 表面上 TLL 吸附量的线性依赖性表明 TLL 结构在较低和较高表面覆盖率下是相似的。对溶液中的羧基二乙酸荧光素 (CFDA) 测定吸附 TLL 的活性,其在脂肪酶活性下形成荧光产物。在共聚焦显微镜中测量表面荧光强度增加,作为脂肪酶吸附后时间的函数。很明显,TLL 在亲水表面上更活跃,这表明吸附的 TLL 分子较大部分被定向,与疏水表面相比,活性部位面向溶液。而且,当 TLL 表面覆盖率下降时,大部分活性仍然存在。之前有关同一表面的 TLL 表面移动性报告发现,在亲水表面和 TLL 低表面覆盖率下,横向扩散最高。因此,较高的横向移动性可能导致活性位点向溶液的暴露时间延长,从而提高对水溶性底物的活性。© 2007 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Roca, M.、De Maria, L.、Wodak, S.J.、Moliner, V.、Tuñón, I.、Giraldo, J.
“鸟嘌呤核苷糖苷键构象与核糖核苷酸裂解反应的偶联:对核酸酶催化的意义”
《蛋白质:结构、功能和遗传学 (Proteins: Structure, Function and Genetics)》,第 70 卷第 2 期,第 415-428 页。(2008)

摘要

为了检查依赖鸟嘌呤的 GpA 构象与核糖核苷酸裂解之间的可能关系,在水溶液中进行了两种潜在的平均力 (PMF) 计算。在第一种计算中,使用鸟嘌呤核苷糖苷 (Gχ) 角度作为反应坐标,并且计算两个 GpA 离子种类:质子化(中性)或去质子化(带负电)鸟嘌呤核苷核糖 O2'。对于两种离子形式,获得类似的能量分布特征,其具有对应于反式和顺式 Gχ 区域的两个最小值。对于这两种形式,反式构象都比顺式构象更稳定,并且获得了 〜4kcal/mol 的反式→顺式转变屏障。结构分析显示磷酸基团对 Gχ 角的构象具有显著的敏感性,表明这种构象与核糖核苷酸裂解机制之间可能存在联系。这一假设得到了第二种 PMF 计算的证实,其中去质子化 GpA 的 O2′-P 距离被用作反应坐标。从两个选定的起点进行计算:在去质子化鸟嘌呤核苷核糖 O2' 的第一种 PMF 研究中确定的反式和顺式最小值。模拟结果显示,沿着顺式 Gχ 的 O2' 攻击比沿着反式 Gχ 更有利:在能量方面,在顺式构象中得到 O-P 键形成屏障显著低于反式构象;在结构方面,相对于反式构象,在顺式构象中观察到的 O2′-P 初始距离较小,针对直线攻击的取向更适合。这些结果与核酸酶 - 核糖核苷酸复合物的催化能力构象一致,其需要底物的鸟嘌呤顺式构象,使得能够通过通用碱基 Glu73 提取核糖 H2' 质子,从而表明反应性底物构象和酶结构和机制之间的偶联。© 2007 Wiley-Liss, Inc.


Sonesson, A.W.、Blom, H.、Hassler, K.、Elofsson, U.M.、Callisen, T.H.、Widengren, J.、Brismar, H.
“用全内反射荧光相关光谱法 (TIR-FCS) 研究疏水界面上的蛋白质-表面活性剂相互作用”
《胶体与界面科学杂志 (Journal of Colloid and Interface Science)》,第 317 卷第 2 期,第 449-457 页。(2008)

摘要

这项工作的目的是通过全内反射荧光相关光谱法 (TIR-FCS) 来研究存在或不存在竞争性表面活性剂的情况下靠近固体表面的蛋白质动力学。研究了两种不同的蛋白质,牛血清白蛋白 (BSA) 和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶 (TLL)。使用非离子/阴离子 (C12E6/LAS) 表面活性剂复配物来模拟洗涤剂配方,并且使用的表面是 C18 封端的玻璃。研究发现随着表面活性剂浓度增加,表示表面结合的自相关函数 (ACF) 的项减少。这表明表面活性剂使蛋白质与疏水表面竞争。当将测量的 ACF 拟合到表面动力学模型中时,观察到随着 C12E6/LAS 浓度的增加,两种蛋白质的表面相互作用速率增加。在这些实验条件下,这意味着蛋白质结合到表面的时间减少了。在 10 μM C12E6/LAS 时,表面相互作用对于 BSA 是不可见的,而在 TLF 的 ACF 中仍然是可区分的。这表明 TLL 相较于 BSA,对 C18 表面具有更高的亲和力。研究表明,TIR-FCS 提供了量化表面活性剂对蛋白质吸附作用的有用工具。© 2007 Elsevier Inc. 保留所有权利。


Rodriguez-Larrea, D.、Ibarra-Molero, B.、De Maria, L.、Borchert, T.V.、Sanchez-Ruiz, J.M.
“超越 Lumry-Eyring:蛋白质变性的操作可逆性/不可逆性的意外模式”
《蛋白质:结构、功能和遗传学 (Proteins: Structure, Function and Genetics)》,第 70 卷第 1 期,第 19-24 页。(2008)

摘要

我们已经发现,与天真的直觉相反,尿素溶液中绵毛嗜热丝孢菌(一种重要的工业酶)的脂肪酶热变性的操作可逆性程度,在蛋白质被加热到温度诱导变性过渡结束几度以上时达到最大。在冷却至室温后,蛋白质似乎达到与初始天然状态相似的酶活性状态,但变性温度较高,在不可逆变性易感性方面的表现完全不同。这些结果表明,蛋白质变性的操作可逆性/不可逆性模式可能比通常想当然的两种情况分类(可逆性与不可逆性)更复杂。此外,它们与下述推测相一致:可能存在天然条件下被高动力学屏障分开的不同天然或类天然状态,并且指明了实验程序来达到和研究这种“替代”天然状态。© 2007 Wiley-Liss, Inc.

 

Jauffred, L.、Callisen, T.H.、Oddershede, L.B.
“用光镊从大肠杆菌中提取粘弹性膜系绳”
《生物物理学期刊 (Biophysical Journal)》,第 93 卷第 11 期,第 4068-4075 页。(2007)

摘要

通过非特异性地将微珠附着到外膜并使用光学镊子将其拉开,在活的大肠杆菌细菌和微珠之间形成系绳。释放后,微珠返回至细菌,因此显示微珠和细菌之间存在弹性系绳。这些系绳可能长达几十微米,是细菌长度的几倍。使用表达外膜结构不同部分的突变体,我们显示了完整的核心脂多糖是系绳形成的必要条件,不管微珠是未包被的聚苯乙烯还是微珠经凝集素包被。已经对系绳进行了物理表征,得出粘弹性系绳力-拉伸关系:对于第一牵引绳,10-12 pN/μm 的弹簧常数描述了系绳的粘弹性,对于随后牵引,弹簧常数降低到 6-7 pN/μm,观察到典型的弛豫时间量程为数百秒。在存在蛋白酶/脂肪酶和淀粉酶的情况下,系绳稳定性研究使我们提出提取的系绳主要由含有外膜双层的不对称脂多糖组成。这种非特异性的栓系附着机制可能在细菌粘附启动中非常重要。© 2007 Biophysical Society 版权所有。


Bagger, H.L.、Øgendal, L.H.、Westh, P.
“溶质对血清白蛋白不可逆性聚集的影响”
《生物物理化学 (Biophysical Chemistry)》,第 130 卷第 1-2 期,第 17-25 页。(2007)

摘要

牛血清白蛋白 (BSA) 的热应力通过形成分子间 β-折叠来促进蛋白质聚集。我们已经使用光散射法和色谱法来研究 (< 1 M) Na2SO4、NaSCN、蔗糖、山梨糖醇和尿素对热聚集速率的影响。这两种盐均为 BSA 聚集的强抑制剂,与非离子溶质(或纯缓冲液)相比,它们可减少聚集颗粒的尺寸和数量(浓度)。因此,盐似乎抑制了成核和生长速率。非电解质添加剂降低了初始聚集速率(与纯缓冲液相比),但并未显著限制 27 分钟热暴露后淬灭的样品中的聚集程度(所有样品中聚集 40-50%)。然而,非电解质确实改变了聚集过程,因为它们始终比纯缓冲液带来更小但更集中的聚集体。按照联系路线和过渡态理论对结果进行讨论。在该框架中,聚合过程的速率由热变性态 (D) 和过渡态 D≠ 之间的平衡决定。因此,溶质的作用分别依赖于它们与 D 和 D≠ 的优先相互作用。当前结果没有显示出溶质与天然 BSA 的优先相互作用和它们对聚集速率的影响之间存在任何相关性。这表明非特异性“Hofmeister 型”相互作用与溶剂可及表面积成比例,并不重要。相反,表明盐诱导的聚集抑制取决于 D≠ 状态中特定静电力的调节。© 2007 Elsevier B.V. 保留所有权利。


Nordkvist, M.、Nielsen, P.M.、Villadsen, J.

“雪霉微座孢碳水化合物氧化物酶将乳糖氧化为乳糖酸:动力学和操作稳定性”
《生物技术与生物工程 (Biotechnology and Bioengineering)》,第 97 卷第 4 期,第 694-707 页。(2007)

摘要

对通过雪霉微座孢碳水化合物氧化酶将乳糖氧化为乳糖酸进行了研究。在 pH 值 6.4 和 38℃ 下,通过传统酶分析获得的乳糖 Km 值为 0.066 mM。在搅拌釜反应器中,通过在恒定 pH 值和温度下进行反应来研究氧对酶的反应速率以及酶的操作稳定性的影响。所有反应中均包含过氧化氢酶,以避免过氧化氢对氧化酶的抑制和失活。在 pH 值 6.4 和 38℃ 下,氧的 Km 值为 0.97 mM,而催化速率常数 kcat 为 94 s-1。此外,我们发现氧化酶的操作稳定性取决于用于产生的酸中和作用的碱类型。因此,当使用 2M NaOH 中和含有 50mM 磷酸盐缓冲液的反应介质时,观察到显著的氧化酶失活。此外,我们发现氧化酶在高浓度乳糖下被碱保护而不被去活。提出一个简单的模型来解释所得到的结果。© 2006 Wiley Periodicals, Inc.


Bagger, H.L.、Hoffmann, S.V.、Fuglsang, C.C.、Westh, P.
“糖蛋白-表面活性剂相互作用:植酸酶-SDS 系统的量热和光谱研究”
《生物物理化学 (Biophysical Chemistry)》,第 129 卷第 2-3 期,第 251-258 页。(2007)

摘要

研究了十二烷基硫酸钠 (SDS) 和两种来自隔孢伏革菌的植酸酶的糖变体的相互作用。一个变体 (Phy) 被严重糖基化,而另一个 (dgPhy) 被酶解去糖基化。通过等温滴定量热法 (ITC) 和同步辐射圆二色谱 (SRCD) 研究在 24℃ 下滴定 SDS 对 Phy 和 dgPhy 的影响。使用两种变体的结果比较来阐明聚糖-表面活性剂相互关系。CD 光谱表明,两种变体的天然和 SDS-变性状态是相互相似的,因此,两个糖变体的变性过程在结构上是等同的。变性状态远未完全展开,可能保留了大量的天然结构。此外,发现聚糖对 SDS 诱导变性的抗性仅有少量增加。对于两种变体,变性半数蛋白质分子所需的 SDS 浓度差异小于 1mM。两种变体对 SDS 的亲和力均非常低。不同阶段的结合等温线下,结合 SDS 量 (w/w) 比大多数先前研究的球状蛋白质报告的量低 3-10 倍。聚糖和肽基团的相对亲和力分析表明碳水化合物结合少得多的表面活性剂。在饱和时,聚糖吸附 Phy 的肽基团约一半的 SDS(以 g/g 为单位),约比平均蛋白质少五倍。© 2007 Elsevier B.V. 保留所有权利。


Sonesson, A.W.、Elofsson, U.M.、Callisen, T.H.、Brismar, H.
“使用量子点追踪三肉豆蔻精基质表面上的单个脂肪酶分子”
《朗缪尔 (Langmuir)》,第 23 卷第 16 期,第 8352-8356 页。(2007)

摘要

已经使用单个分子追踪三肉豆蔻精基质表面来分析单个脂肪酶分子的迁移率。这是通过将脂肪酶结合到量子点并通过共焦激光扫描显微镜在旋涂的三豆蔻精表面上成像来实现的。收集单个脂肪酶分子的图像序列,通过分析计算的轨迹的均方位移来量化扩散系数。在无流动条件下,脂肪酶扩散系数为 (8.0 ±5.0) ×10-10cm2/s。轨迹具有一个“串珠”外观,脂肪酶分子限制在表面的某些区域,然后迁移到另一个扩散继续受限的区域。这引起了轨迹中的群集。当流动应用到系统,集群之间的总距离和平均步长增加,但集群地区内的限制扩散不受影响。这可以通过在表面上以两种不同模式操作的脂肪酶进行解释。在集群区域中,脂肪酶可能以活性位点朝向表面并水解基质。在这些区域之间,提出了脂肪酶与表面接触但受外部流动影响的扩散过程。© 2007 美国化学学会。


Nordkvist, M.、Nielsen, P.M.、Villadsen, J.
“雪霉微座孢碳水化合物氧化酶将乳糖氧化为乳糖酸:动力学和操作稳定性”
《生物技术与生物工程 (Biotechnology and Bioengineering)》,第 97 卷第 4 期,第 694-707 页。(2007)

摘要

对通过雪霉微座孢碳水化合物氧化酶将乳糖氧化为乳糖酸进行了研究。在 pH 值 6.4 和 38℃ 下,通过传统酶分析获得的乳糖 Km 值为 0.066 mM。在搅拌釜反应器中,通过在恒定 pH 值和温度下进行反应来研究氧对酶的反应速率以及酶的操作稳定性的影响。所有反应中均包含过氧化氢酶,以避免过氧化氢对氧化酶的抑制和失活。在 pH 值 6.4 和 38℃ 下,氧的 Km 值为 0.97 mM,而催化速率常数 kcat 为 94 s-1。此外,我们发现氧化酶的操作稳定性取决于用于产生的酸中和作用的碱类型。因此,当使用 2M NaOH 中和含有 50mM 磷酸盐缓冲液的反应介质时,观察到显著的氧化酶失活。此外,我们发现氧化酶在高浓度乳糖下被碱保护而不被去活。提出一个简单的模型来解释所得到的结果。© 2006 Wiley Periodicals, Inc.


Faber, C.、Hobley, T.J.、Mollerup, J.、Thomas, O.R.T.、Kaasgaard, S.G.
“对等电点附近的改性地衣芽孢杆菌 α-淀粉酶的溶解度研究”
《化学与工程数据杂志 (Journal of Chemical and Engineering Data)》,第 52 卷第 3 期,第 707-713 页。(2007)

摘要

已经通过分批结晶研究了改性重组地衣芽孢杆菌 α-淀粉酶 (mBLA) 的溶解度。选择含有 5 个亚型的半纯制品,其中 pi 值为 6 至 7.3(加权平均值 6.6)。也存在少量 (<1%) 的蛋白质杂质。在 6-8 的 pH 值范围内研究了溶解度。在 pH 值为 7 时,不含盐的最低溶解度为 60mg·mL-1。在硝酸盐、硫酸盐和硫氰酸盐中添加 0.1mol·L-1 钠盐对溶解度的影响很小。不过,在所有 pH 值条件下,添加 0.5mol·L-1 硫酸钠可显著降低溶解度,而在 pH 值为 7 和 pH 值为 8 的条件下,添加 0.5mol·L-1 硫氰酸钠溶液可增加溶解度。阴离子对 α-淀粉酶溶解度的影响遵循 Hofmeister 序列,在等电点以下,只有微弱的逆转迹象。阳离子对溶解度的影响很小。在存在和不存在 0.1mol·L-1 盐的条件下,测定 α-淀粉酶 ζ 电位的符号和大小。ζ 电位定性地正确预测了不同的盐对 mBLA 溶解度的影响。© 2007 美国化学学会。


Nielsen, A.D.、Borch, K.、Westh, P.
“特异腐质霉角质酶在 SDS 水溶液中的热稳定性”
《物理化学杂志 B (Journal of Physical Chemistry B)》,第 111 卷第 11 期,第 2941-2947 页。(2007)

摘要

以前已显示特异腐质霉的角质酶 (HiC) 结合异常低量的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠 (SDS)。在目前的工作中,我们已经应用扫描和滴定量热法来研究这种弱相互作用与 SDS 对 HiC 平衡和动力学稳定性的影响之间的可能关系。结果以“状态图”表示,该图指定蛋白质的稳定形式作为温度和 SDS 浓度的函数。与其他蛋白质相比,SDS 大大降低了平衡稳定性 HiC。对于较低 SDS 浓度(SDS:HiC 摩尔比,MR < 8),也发现该特征适用于蛋白质的动力学控制的热聚集。然而,在较高的 MR 值下,SDS 显著性稳定不可逆的聚集。我们提出这依赖于逐渐带负电的 HiC-SDS 复合物的静电排斥。量热和结合数据的组合解释允许计算在饱和点附近 HiC 和 SDS 关联的热函和热容的变化。后者的函数约为 -410 J mol-1 K-1 或类似于胶束形成的热容量变化 (-470 J mol-1 K-1)。这表明 SDS 以胶束和蛋白质相关形式水合到相似程度。使用 Wyman 理论对连接平衡的结果进行了讨论。按照这些路线的定量分析表明蛋白质的可逆热去折叠与 2-3 个额外 SDS 分子结合偶联。这相当于结合数量增加了 15-20%。Wyman 理论也使本研究中观察到的低亲和力和高敏感性之间的关系合理化。© 2007 美国化学学会。


Bertram, H.C.、Kristensen, M.、Østdal, H.、Baron, C.P.、Young, J.F.、Andersen, H.J.
“氧化是否影响肌原纤维蛋白质的水分功能?”
《农业化学与食品化学杂志 (Journal of Agricultural and Food Chemistry)》,第 55 卷第 6 期,第 2342-2348 页。(2007)

摘要

使用低场质子核磁共振 (NMR) T2 弛豫测量法来表征从猪肌肉提取的肌原纤维以及在暴露和不暴露于 H2O2 的情况下添加的血红蛋白的水结合特性。研究了 pH 和离子强度对样品的影响,当 pH 值调节至 5.4、6.2 和 7.0 时,离子强度分别调节至 0.29、0.46 和 0.71 M。作为氧化蛋白质交联指标的二酪氨酸形成显示在 H2O2 活化后二酪氨酸浓度显著增加。二酪氨酸的形成具有强烈的 pH 依赖性并且随着 pH 值降低而增加。另外,加入 H2O2 后观察到硫代巴比妥酸反应性物质的水平增加,这意味着脂质氧化增强,然而,与肌原纤维蛋白质相比具有不同的氧化模式。低场 NMR 弛豫测量显示,H2O2 活化后 T2 弛豫时间减少,相当于氧化后保水能力降低。然而,在不同的 pH 值和离子强度下,未观察到氧化程度与 T2 弛豫时间之间存在直接的关系,需要进一步的研究来全面了解氧化对肌原纤维功能的影响。© 2007 美国化学学会。


Sonesson, A.W.、Brismar, H.、Callisen, T.H.、Elofsson, U.M.
“嗜热真菌脂肪酶在三肉豆蔻精基质表面上的流动性”
《朗缪尔 (Langmuir)》,第 23 卷第 5 期,第 2706-2713 页。(2007)

摘要

我们已经在共聚焦显微镜设置中使用光漂白后的荧光恢复 (FRAP) 研究了旋涂的三肉豆蔻精基质表面上活性和失活嗜热真菌脂肪酶 (TLL) 的流动性。通过光漂白吸附在平滑三肉豆蔻精表面上的荧光标记 TLL 的圆形斑点,扩散系数 D 和流动级数 f 均可以被量化。在具有不同表面密度的脂肪酶表面上进行 FRAP,并且在吸附之后作为时间函数进行。数据显示,与我们之前在疏水模型表面上的研究相比,三肉豆蔻精基质表面上 TLL 的移动性显著更高。对于这两种脂肪酶变体,在脂肪酶相对表面密度较高的情况下,扩散降低到相似比率,表明拥挤效应占优势,脂肪酶的吸附量较高。然而,活性 TLL 的外延无限表面稀释的扩散系数比无活性高(D0 = 17.9 × 10-11 cm2/s 对比 D0 = 4.1 × 10-11 cm 2/s,吸附后的首个时间间隔数据)。而且,吸附后扩散随时间下降,对活性 TLL 最为明显。我们通过产物抑制来解释结果,即负电荷脂肪酸产物的蓄积随着时间推移降低了活性脂肪酶的扩散速率。这得到序贯吸附实验的支持,其中在流动条件下吸附量作为吸附后时间的函数被研究。与无活性 TLL 的预处理相比,使用活性 TLL 预处理三肉豆蔻精表面时,第二次脂肪酶注射导致吸附量显著降低。© 2007 美国化学学会。


Xu, F.、Ding, H. 
“一种用于非均相(或空间受限)酶催化的新动力学模型:来自分形和干扰(过度拥挤)效应的贡献”
《应用催化 A:一般 (Applied Catalysis A: General)》,第 317 卷第 1 期,第 70-81 页。(2007)

摘要

非均相催化涉及以不同相分离的催化剂和反应物。在这些系统中,反应物和催化剂之间的相互作用可能与其均匀的对应物大不相同,因为扩散和分子碰撞过程的特点在尺寸小于三的空间中抑制。分形理论是针对数学、物理、化学和生物过程而开发的,具有固有的不规则性和复杂性,可用于非均相催化。为了更好地理解非均相酶反应,将一般分形理论应用于均相酶反应的经典模型之后,重新形成了分形米曼氏动力学。也研究了受限空间中酶/基质过度拥挤引起的动力学“干扰”效应。新的动力学模型应用于纤维素水解酶的纤维素水解,纤维二糖水解酶是一种具有代表性的非均相生物催化体系,由于酶在不溶性基质上的强表面吸附以及一维“进行性”酶促机制而具有高分形性。讨论了该模型在研究和应用其他酶促反应中的作用。© 2006 Elsevier B.V. 保留所有权利。


Balashev, K.、John DiNardo, N.、Callisen, T.H.、Svendsen, A.、Bjørnholm, T.
“由于磷脂酶 A2 和绵毛状腐质霉脂肪酶作用的脂质双层降解的原子力显微镜可视化”
《生物化学与生物物理学报 - 生物膜 (Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes)》,第 1768 卷第 1 期,第 90-99 页。(2007)

摘要

液体细胞原子力显微镜 (AFM) 的一个重要应用是研究模仿体内系统的有组织分子介质中的酶结构和行为。在这项研究中,我们证明了使用 AFM 作为工具来研究支持脂质双层表面发生脂解酶反应的动力学。尤其是,研究了磷脂酶 A2 (PLA2) 和绵毛状腐质霉脂肪酶 (HLL) 降解脂纸双层的时间过程。接触模式成像允许以高横向分辨率显示基质上的酶活性。通过 Langmuir-Blodgett 技术制备脂质双层并转移到 AFM 液体细胞。在将酶注入液体细胞之后,定期获取一系列图像,以允许识别基质结构、酶活化的优选位点和酶反应速率。© 2006 Elsevier B.V. 保留所有权利。


Seema, Kumari, R.、Gupta, G.、Saluja, D.、Kumar, A.、Goel, S.、Tyagi, Y.K.、Gulati, R.、Vinocha, A.、Muralidhar, K.、Dwarakanth, B.S.、Rastogi, R.C.、Parmar, V.S.、Patkar, S.A.、Raj, H.G.
“使用多酚全乙酰化作为乙酰基供体从人类胎盘表征蛋白转乙酰酶作为信号传导分子钙网蛋白”
《细胞生物化学与生物物理学 (Cell Biochemistry and Biophysics)》,第 47 卷第 1 期,第 53-64 页。(2007)

摘要

我们早先已经表明,独特的膜结合酶介导乙酰基从多酚全乙酰化 (PA) 向功能性蛋白质的转移,由于其作用于几类 PA,所以被称为乙酰氧基药物:蛋白转乙酰酶 (TAase)。在本文中,我们报告了从人类胎盘微粒体纯化 TAase 至分子质量为 60 kDa 的同质性,对几类 PA 表现出不同程度的特异性,证实了微粒体结合 TAase 的结构-活性关系。通过乙酰化靶蛋白与抗乙酰赖氨酸抗体的免疫反应性证明,建立了通过模型乙酰氧基药物 7,8-二乙酰氧基-4-甲基香豆素 (DAMC) 的 TAase 催化蛋白乙酰化。在钙聚集的微粒体中以及在将 Ca2+ 加入到纯化的 TAase 中时,TAase 活性受到严重抑制,这表明 TAase 可能是钙结合蛋白。此外,使用瑞士 Prot 数据库对纯化的 TAase (EPAVYFKEQFLD) 进行的 N 末端序列分析与钙网蛋白 (CRT),即内质网 (ER) 的一种主要微粒体钙结合蛋白完美匹配。通过观察到纯化的 TAase 与针对人 CRT(13个残基肽,DEEDATGQAKDEL)的 C 端产生的市售抗体发生反应,证实了 TAase 与 CRT 的身份。纯化 TAase 也表现出 Ca2 + 结合特征,并作为蛋白激酶 C (PKC) 催化磷酸化的基质,这是 CRT 的标志性特征。此外,纯化胎盘 CRT 以及市售的纯 CRT 产生显著的 TAase 催化活性,并且还发现对于通过 DAMC 介导靶蛋白 NADPH 细胞色素 P-450 还原酶的乙酰化是有效的,正如通过使用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质免疫印迹检测到的。这些观察结果首次令人信服地将转乙酰酶功能归因于 CRT。因此,CRT 的这种转乙酰酶功能被称为钙网蛋白转乙酰酶 (CRTAase)。我们设想 CRTAase 通过不依赖于乙酰辅酶 A 的乙酰化方式在蛋白质修饰中发挥重要作用。© 2007 Humana Press Inc. 版权所有。保留任何性质的所有权利。


Rathore, N.、Gellman, S.H.、De Pablo, J.J.
β-肽螺旋的热力学稳定性和环状残基的作用
《生物物理学期刊 (Biophysical Journal)》,第 91 卷第 9 期,第 3425 - 3435 页。(2006)

摘要

β-肽日益成为一类有吸引力的拟肽分子。与天然存在的 α-肽相反,β-氨基酸的短寡聚物(仅包含 4-6 个单体)表现出稳定的二级结构,使其适合就特定化学相互作用对结构的影响进行定量、一致的实验和理论研究。在这项工作中,使用分子模拟来研究由含有不同比例的无环 (β3) 和环状 (ACH) 残基的 β-肽形成的螺旋构象的热力学稳定性。更具体地说,在这项工作中考虑了几种仅在其环状残基含量上不同的 β-肽。以前对 β-肽的计算研究主要依赖于分子动力学模拟的能量最小化。相反,我们的研究依赖于基于密度状态的蒙特卡洛模拟来计算自由能并且沿着明确定义的有序参数检查这些分子的各种折叠结构的稳定性。通过借助扩展系统形式主义,我们能够确定展开非折叠特定分子所需的自由能,这个量可以通过单分子力谱直接测量。在隐式和显式溶剂中的模拟已经允许系统地研究环状残基和静电对二级结构的稳定性的作用。在这项工作中考虑的分子经证明显示出稳定的 H-14 螺旋构象,并且在某些情况下,显示出相对稳定的 H-12 构象,从而表明可以使用溶剂质量来操纵这些肽的氢键模式和结构。© 2006 Biophysical Society 版权所有。


Ransbarger, D.、Xu, F.
“通过青霉素和衍生物激活漆酶”
《过程生物化学 (Process Biochemistry)》,第 41 卷第 9 期,第 2082-2086 页。(2006)

摘要

漆酶能够氧化多种还原物质,在各种生物催化应用中有着广阔的前景。为了改善漆酶的活性、特异性和稳定性,已开展广泛研究。我们观察到,通过使用盘尼西林进行预培养,可显著激活立枯丝核菌漆酶,但盘尼西林不是酶的氧化还原底物。激活主要影响漆酶的催化常数,当 pH 值为 5 时效果最佳。氨比西林和青霉噻唑酸在漆酶上也具有活性(虽然其效果比盘尼西林更弱),但 6-氨基青霉烷酸、苯乙酸和头孢氨苄没有活性。盘尼西林的效果之所以明显,是由于与漆酶多肽主链的氧化还原作用。在​嗜热毁丝菌和长绒毛栓菌漆酶上,效果明显较弱。© 2006 Elsevier Ltd. 保留所有权利。


Rodriguez-Larrea, D.、Minning, S.、Borchert, T.V.、Sanchez-Ruiz, J.M.
“溶剂化屏障在蛋白质动力稳定性中的作用”
《分子生物学期刊 (Journal of Molecular Biology)》,第 360 卷第 3 期,第 715-724 页。(2006)

摘要

已证明多个相关蛋白质系统的稳定性以动力学为基础。除了明显的生物技术影响,鉴于一些新兴的分子化淀粉样蛋白生成抑制方法侧重于提高蛋白质天然状态的动力稳定性,这一事实强调了理解蛋白质动力稳定性的综合益处。​脂肪酶是最重要的工业酶之一。在本文中,我们研究了疏绵状嗜热丝孢菌中野生型脂肪酶(四种单一突变体和两种高度稳定的多突变体)的热变性。在所有案例中,热变性不可逆,受动力学控制,并且符合双态不可逆模型。该结果证明,高稳定性变体的制备过程中涉及的注重分子动力学的全新定向进化方法之所以成功,可能是因为该方法解决了动力稳定性,特别是因为加热的分子动力学模拟可能会识别处于过渡状态的已破坏本地作用区域,以达到不可逆变性。此外,我们发现对活化焓和熵产生了非常大的突变效应,但是尿素动力学 m 值没有出现类似的大幅度变化。我们据此得出结论:对于与可溶性大幅变化无关的不可逆变性过程,这些突变效应与处于过渡状态的一些结构特征相关联。近期的计算研究表明,至少一些蛋白质折叠/去折叠流程中存在溶剂化/去溶剂化屏障。因此,我们提出,溶剂化屏障(因内部联系断裂和渗水性之间的非同步而引起)可能有助于促进疏绵状嗜热丝孢菌中脂肪酶的动力稳定性(并且可能也会促进其他蛋白质的动力稳定性)。© 2006 Elsevier Ltd. 保留所有权利。


Sonesson, A.W.、Elofsson, U.M.、Brismar, H.、Callisen, T.H.
“脂肪酶在存在表面活性剂的疏水面上的吸附性和流动性”
《朗缪尔 (Langmuir)》,第 22 卷第 13 期,第 5810-5817 页。(2006)

摘要

我们研究了非离子/阴离子表面活性剂 C12E1/LAS (1:2 mol %) 对从疏棉状嗜热丝孢菌 (ILL) 中获取的脂肪酶的吸附性和表面流动性的影响,目的是希望能够控制界面催化所涉及的过程。使用表面等离子体共振 (SPR) 和椭圆偏振法分析疏水模型表面上表面活性剂和 TLL 之间的竞争吸附过程,以模仿脂肪酶的油性底物。在使用十八烷基三氯硅烷 (OTS) 进行硅烷化的二氧化硅上,通过使用共聚焦激光扫描显微镜进行荧光光漂白恢复 (FRAP) ,我们获得了荧光标记 TLL 变体的表面扩散系数。通过椭圆偏振法,我们校准了荧光强度和脂肪酶的表面密度。在使用不同浓度的 C12E6/LAS 进行共吸附后,按照两个时间间隔,在酶的不同表面密度下测量了 TLL 扩散。选择表面活性剂浓度,以代表低于临界胶束浓度 (CMC)、处于 CMC 范围和高于 CMC 的浓度。明显的 TLL 表面扩散外推到无限表面稀释度,D 0。我们发现,表面活性剂是否存在对 TLL 的表面流动性有着显著影响:D0 = 0.8 × 10-11 cm2/s(无表面活性剂)和 D0 = 13.1 × 10 -11 cm2/s(含有高于 CMC 的表面活性剂)。通过 CMC 时,除了脂肪酶流动性增加,TLL 的流动分数也提高了 2 倍。SPR 分析表明,表面结合的 TLL 以浓度相关方式被 C12E6/LAS 取代,这表示观察到的表面流动性增加影响了体积调节的扩散和所谓的 TLL 与表面重新结合。关于脂肪酶/表面活性剂竞争吸附和脂肪酶表面流动性,我们的综合结果显示,从生理消化到去污力等技术应用,表面活性剂对调整界面催化发挥了重要作用。© 2006 美国化学学会。


Raj, H.G.、Kumari, R.、Seema, Gupta, G.、Kumar, R.、Saluja, D.、Muralidhar, K.M.、Kumar, A.、Dwarkanath, B.S.、Rastogi, R.C.、Prasad, A.K.、Patkar, S.A.、Watterson, A.C.、Parmar, V.S.
“钙网蛋白的新功能:独立于使用多酚乙酸盐的乙酰辅酶 A,钙网蛋白作为可调节转乙酰酶的蛋白乙酰化个体”
《理论与应用化学 (Pure and Applied Chemistry)》,第 78 卷第 5 期,第 985-992 页。(2006).

摘要​

在早期调查中,我们在哺乳动物细胞中发现了一种独特的膜结合酶,这种酶可以催化多酚乙酸盐 (PA) 中的乙酰基团转移到特定的功能蛋白, 从而调节其活性。由于这种酶会与多个类别的 PA 发生反应,因此被称为乙酰氧基药物:蛋白质转乙酰酶 (TAase)。TAase 从大鼠肝微粒体中纯化,以达到同质性,并表现出 55 KDa 的分子量。通过展示一氧化氮合成酶 (NOS) 等乙酰化靶蛋白与抗乙酰赖氨酸的免疫反应性,证明在 TAase 的催化下可通过 PA 对蛋白质进行乙酰化。如上所述,通过使用 PA 对人类血小板 NOS 进行乙酰化,细胞内的一氧化氮 (NO) 水平得到增强。与父多酚不同,我们发现 PA 表现出与 NO 相关的生理效应。我们发现,N 端序列与成熟钙网蛋白 (CRT) 的 N 端序列表现出 100% 同源性。通过展示 CRT 的属性,如与钙网蛋白抗体的免疫反应性、与 Ca2+ 离子结合、作为通过蛋白激酶 c (PKC) 进行的磷酸化作用的底物(这些都是 CRT 的标志性特征),证明了可通过内质网 (ER) 蛋白质 CRT 识别 TAase。这些观察结果首次令人信服地证明了 CRT 的转乙酰酶功能,如果通过独立于乙酰辅酶 A 的生化机制执行各种酶的乙酰化,从而进行蛋白质改性,该功能可能起到重要作用。© 2006 IUPAC.


Høiberg-Nielsen, R.、Fuglsang, C.C.、Arleth, L.、Westh, P.
“对于隔孢伏革菌植酸酶,糖基化和聚集动力学之间的关系”
《生物化学 (Biochemistry)》,第 45 卷第 15 期,第 5057-5066 页。(2006)

摘要

通过动态 (DLS) 和静态 (SLS) 光散射法研究了糖蛋白隔孢伏革菌植酸酶 (Phy) 和去糖基化形式 (dgPhy) 的热诱导聚集动力学。这为形成细微酶聚集体(∼10-100 个分子)的时间过程提供了详细说明。另外,使用扫描量热法 (DSC) 研究了这两种形式的热力学稳定性。我们发现,聚糖显著促进了动力稳定性(即,降低不可逆变性的速度),同时 DSC 定义的平衡变性温度 T d 基本不变。例如,在 pH 值为 4.5-5.0 时,尽管 Td 差异仅为 1-3 °C,但 dgPhy 的聚集速度比 Phy 快约 200 倍。为了阐明聚糖促进动力稳定性所依赖的机制,我们衡量了离子强度和温度对聚集速度的影响。此外,通过 SLS 测量了这两种形式的第二维里系数 (B22)。这些结果表明,Phy 的聚集速度按比例随热变性蛋白质的浓度扩大或缩小。关于热变性状态的浓度,这表示一级动力学。对于 dgPhy,发现了类似但不那么明显的关联,并且我们认为,虽然去糖基化形式的聚集过程由变性蛋白主导,但也涉及因关联天然状态分子而带来的较小贡献作用。B22 的测量结果表明,dgPhy 的值略高于 Phy。​这意味着,与 Phy 相比,dgPhy 与缓冲剂的相互作用更有利,因此排除了聚糖的强水合性对动力稳定性的起始影响。基于这一点和 pH 值与离子强度的影响,我们认为,聚集抑制更有可能依赖于聚糖(处于蛋白质的聚集形式)的位阻现象。© 2006 美国化学学会。


Bagger, H.L.、Fuglsang, C.C.、Westh, P.
“糖蛋白的水合作用:肽和聚糖基团的相对亲水性”
《欧洲生物物理学期刊 (European Biophysics Journal)》,第 35 卷第 4 期,第 367-371 页。(2006)

摘要

糖基化是最普遍的蛋白质翻译后修饰,可影响许多物理特性,包括与周边含水溶剂的相互作用。关于通常在糖蛋白中观察到的溶度提高,已讨论此类聚糖-水相互作用,但该关联的实验支持仍然较少。对于相同蛋白质的糖蛋白植酸酶 (Phy) 和去糖基化形式 (dgPhy),我们已应用双通道量热法来测量水合作用在 25°C 时的自由能和焓。Phy 与 dgPhy 的结果对比表明,多肽基团的亲水性高于聚糖。事实上,在适当的水合作用程度(∼0.3 g 水/g 高分子)下,吸水性似乎完全受控于肽基的吸附性能。我们的结论是,对于报告中经常出现的因蛋白质糖基化而造成的溶度提高和聚集倾向降低,增强与溶剂的相互作用不太可能是其背后的机制。© EBSA 2005.


Hedin, E.M.K.、Høyrup, P.、Patkar, S.A.、Vind, J.、Svendsen, A.、Hult, K.
“根据 ESR 光谱的研究,表面电荷和曲率对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶结合位向的影响”
《生物化学 (Biochemistry)》,第 44 卷第 50 期,第 16658-16671 页。(2005)

摘要

甘油三酯脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 具有高亲和力的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶 (TLL) 与单层磷脂囊泡(作为脂肪酶和底物的稀释剂界面)相结合,但只在带有负电荷的小囊泡上表现出界面活化 [Cajal, Y. 等人。(2000)《生物化学 (Biochemistry)》第 39 卷,413-423]。以前,在包含 1-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三醇-3-磷脂酰甘油 (POPG) 的小单层囊泡 (SUV) 的脂质-水界面,TLL 的生产模式结合位向通过电子自旋共振 (ESR) 光谱与定点自旋标记相结合进行确定 [Hedin, E. M. K., 等人。(2002)《生物化学》41,14185-14196]。在实验中,我们研究了与包含 POPG 的大单层囊泡 (LUV) 结合时以及与包含 1-棕榈酰-2-油酰-sn-丙三醇-3-磷脂酰胆碱 (POPC) 的 SUV 结合时的 TLL 界面位向。如上文所述,11 个单半胱氨酸 TLL 突变体带有自旋标记,在膜结合时使用水溶性自旋弛豫剂铬 (III) 草酸盐 (Crox) 进行研究。此外,丹酰标记的囊泡表明了 TLL 上的每个自旋标记和脂膜之间的分子间荧光淬灭效率。ESR 暴露和荧光淬灭数据显示,与带有两性离子的 PC 表面相比,TLL 与带有负电荷的 PG 表面更加相关联,并且如接触残基 K74C-SL、R209C-SL 和 T192C-SL 所示,主要通过活性部位对面的 TLL 凹形背部与 POPG LUV 和 POPC SUV 结合。与 POPG SUV 相比,该位向明显不同,这或许可以解释脂肪酶活化的差异。很明显,囊泡表面的电荷与易接近性(曲率)决定了磷脂界面的 TLL 位向。© 2005 美国化学学会。


Sonesson, A.W.、Callisen, T.H.、Brismar, H.、Elofsson, U.M.
“通过荧光光漂白恢复技术研究脂肪酶表面扩散”
《朗缪尔 (Langmuir)》,第 21 卷第25 期,第 11949-11956 页。(2005)

摘要

在亲水性二氧化硅和使用二氯二甲基硅烷 (DDS) 或十八烷基三氯硅烷 (OTS) 进行甲基化的二氧化硅上,我们分析了疏棉状嗜热丝孢菌 (TLL) 变体的表面扩散特性。对于该研究,为了在固体表面上分析扩散,开发了一种新方法。该方法基于使用共聚焦显微镜的荧光光漂白恢复技术。对样本的矩形区域进行光漂白时,荧光恢复可作为一维扩散进行分析,从而获得简化的数据拟合数学表达式。最初,通过在玻璃上测量牛血清蛋白扩散来测试该方法,测试得到的扩散系数与之前报告中的系数相差无几。对于 TLL 扩散的分析,TLL 吸附的椭圆偏振数据用于将荧光强度校准成脂肪酶的表面密度,从而在不同表面密度下测量扩散系数。吸附后,按照两个时间间隔计算平均扩散系数。外推到无限表面稀释度时,在 OTS 表面上,运动分量和扩散系数最低。而且,​在疏水表面上,扩散速度随时间下降。我们的观察结果可通过表面对已吸附 TLL 的位向和构造分布的依赖性进行解释,此时,从已关闭结构到具有催化活性的更疏水的开放结构的过渡非常重要。© 2005 美国化学学会。


Rønne, T.H.、Pedersen, L.S.、Xu, E.
“在酯交换作用中,固定疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的三酰甘油选择性”
《美国石油化学家学会期刊 (JAOCS, Journal of the American Oil Chemists' Society)》,第 82 卷第 10 期,第 737-743 页。(2005)

摘要

在正己烷中两个一元酸 TG 之间的受脂肪酶催化的酯交换反应中,研究了疏棉状嗜热丝孢菌中固定脂肪酶 (Lipozyme TL IM) 的三酰甘油(脂肪酸)选择性。在带有饱和 FA 的一系列 TG 中,从 tri-C4:0 到 tri-C20:0(tri-C6:0 除外),和一系列不饱和 FA 中,从 tri-C18:1 到 tri-C18:3,三硬脂精 (tri-C18:0) 用作参照。量化通过 HPLC 执行,使用了不同的选择性评估方法。所用方法均未显示脂肪酶在不同 TG 上的表现存在显著差异,这表示在所用系统中,Lipozyme TL IM 对 FA 或 TG 无选择性。在正己烷中,响应表面设计用于通过三棕榈精 (tri-C16:0) 和三月桂精 (tri-C12:0) 系统来研究水活性 (aw) 和反应温度对 Lipozyme TL IM 反应性的影响。我们发现,温度升高(40 到 60°C)可显著影响脂肪酶的反应性。当 aw 从 0.1130 变到 0.5289 时,Lipozyme TL IM 的反应性不受影响。aw 增强只会导致 FFA 形成增多。版权所有 © 2005 by AOCS Press.


Nielsen, A.D.、Arleth, L.、Westh, P.
“蛋白质-表面活性剂相互作用的分析 - 通过滴定量热和荧光光谱法研究特异腐质霉角质酶和阴离子表面活性剂之间的相互作用”
《生物物理学报 - 蛋白质与蛋白质组学 (Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics)》,第 1752 卷第 2 期,第 124-132 页。(2005)

摘要

我们通过对系统执行并行量热和荧光研究法(这两种组分的浓度均呈系统化改变),研究了特异腐质霉中的角质酶 (HiC) 和十二烷基硫酸钠 (SDS) 的相互作用。根据总 SDS 浓度,[SDS]tot,绘制时,这两种方法的结果展示出一些同步特性。多个异常现象的分子起源已指定,并识别出了五个由不同相互作用模式控制的 [SDS]tot 间隔。从低到高 [SDS] tot 排列,这些模式分别是:将(一些)SDS 与本地 HiC 结合、形成寡聚蛋白质聚集体、HiC 变性、SDS 吸附在变性蛋白上。对于 >3-6 mM 的 [SDS]tot(具体取决于蛋白质浓度), 吸附饱和,无法检测到进一步蛋白质-洗涤剂相互作用。量热数据中的两个尤为突出的异常分别是由于变性与饱和造成的。我们发现,在这些点,[SDS]tot 与(总)蛋白质浓度,[HiC],呈线性关系。我们认为,这反映了结合与自由 SDS 之间的平衡,[SDS]tot = [SDS] aq + [HiC] Nb,其中 [SDS]aq 和 Nb 分别是指 SDS 的含水(“自由”)浓度和每个蛋白质的结合 SDS 平均数量。对这些行的结果解读显示,在 22°C 和 pH 7.0 的条件下,HiC 变性。Rosgaard, L.、Zygadlo, A.、Scheller, H.V.、Mant, A.、Jensen, P.E.


“将植物光合系统 I 亚基 G 插入类囊体膜:野生型和标记版本蛋白质的体外与体内研究”
《FEBS 期刊 (FEBS Journal)》,第 272 卷第 15 期,第 4002-4010 页。(2005)

摘要

光合系统 I 的亚基 G 是核基因编码的蛋白质,据预测,可形成两个通过环区分离的跨膜 α-螺旋。体外转运试验表明,带正电荷的环域面对基质,而 N 和 C 端最有可能面对细胞腔。将 His 或 Strep 标记置于 C 端或置于环区内的 PSI-G 结构的插入拓扑结构与野生型光合系统 I 亚基 G (PSI-G) 相同。但是,如果标记出现在环区,膜插入的蛋白质明显对胰蛋白酶更敏感,因为环与 PSI 核之间的相互作用被破坏。使用可对 C 端和环标记 PSI-G 蛋白质进行编码的结构转变缺少 PSI-G 的淘汰植物。对转基因株系中的类囊体的试验表明,C 端标记的 PSI-G 采用与野生型 PSI-G 相同的拓扑结构,而环标记 PSI-G 会影响环区对胰蛋白酶的敏感性,从而证实体外观察结果。此外,对转基因植物中 PSI 复合物的纯化表明,所有标记版本的 PSI-G 均结合并保留在 PSI 复合物中,但优先保留 C 端标记的 PSI-G 变体。这表示,要正确集成到 PSI 核,PSI-G 的环区非常重要。我们的实验证明可以在植物中生成 His 和 Strep 标记的 PSI,并提供了进一步证据,证明膜蛋白的拓扑结构取决于正电荷的分布,正电荷不在膜之间转移。© 2005 FEBS.


Nielsen, A.D.、Arleth, L.、Westh, P.
“特异腐质霉角质酶与通过小角度中子散射和等温滴定量热法研究的阴离子表面活性剂的相互作用”
《朗缪尔 (Langmuir)》,第 21 卷第 10 期,第 4299-4307 页。(2005)

摘要

通过小角中子散射 (SDS) 和等温滴定量热法 (ITC) 研究了特异腐质霉 (HiC) 与十二烷基硫酸钠 (SDS) 的角质酶的相互作用。对于相同系统的结构和热力学信息的协同解释,在试图阐明蛋白质-洗涤剂相互作用的复杂模式中证明是有价值的。特别是在 22°C 的实验温度下,SDS 胶束的形成是无热的 (ΔH = 0),并且蛋白质-洗涤剂相互作用的效果在热分析图中明显突出。发现 SDS 对角质酶的作用强烈依赖于样品组成。因此,添加相当于摩尔比 nS = nSDS/n HiC 约 10 的 SDS 导致 HiC/SDS 聚集体的形成,其中包含一个以上蛋白质分子。SANS 结果表明,这种加合物平均含有两个 HiC,ITC 轨迹显示它们形成和分解缓慢。在稍高的 SDS 浓度 (ns = 10-25) 下,这些“二聚体”解离,蛋白质变性。变性显示特征性正焓变,但 HiC 的 SDS 变性状态异常紧凑,回转半径接近天然构象。利用 SDS 进一步滴定与放热结合到变性蛋白质上相关联,直到在约 ns = 90 的饱和点。此时,游离单体浓度为 2.2 mM,结合数为 〜40 SDS/HiC。有趣的是,这种 SDS 结合度 (∼0.5g SDS/g HiC) 小于与典型水溶性蛋白结合量的一半。© 2005 美国化学学会。


Eriksson, J.、Malmsten, M.、Tiberg, F.、Callisen, T.H.、Damhus, T.、Johansen, K.S.
“暴露于特异腐质霉葡糖苷水解酶家族 45 内切纤维素酶的模型纤维素膜 - 碳水化合物结合模块的效应”
《胶体与界面科学杂志 (Journal of Colloid and Interface Science)》,第 285 卷第 1 期,第 94-99 页。(2005)

摘要

采用椭偏测量术测定了纤维素酶特异腐质霉 GH45 的酶结构和活性对模型纤维素底物降解的影响。发现无活性变体 D10N 吸附在纤维素表面,但是也被掺入到纤维素膜中,其程度取决于 pH。对于天然蛋白质,监测无活性变体 D10N 的初始吸附之后是酶介导的纤维素膜降解。再次,发现对 pH 的依赖性,使得较高的 pH 导致酶降解较慢。去除碳水化合物结合模块消除了这种 pH 依赖性,但也导致对纤维素表面的吸附减少,并且净催化作用降低。© 2004 Elsevier Inc. 保留所有权利。


Ternström, T.、Svendsen, A.、Akke, M.、Adlercreutz, P.
“AOT 和盐酸胍对角质酶的开展和灭活”
《生物物理学报 - 蛋白质与蛋白质组学 (Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics)》,第 1748 卷第 1 期,第 74-83 页。(2005)

摘要

我们提出了在盐酸胍 (GdnHCl) 和双(2-乙基己基) 磺基琥珀酸钠 (AOT) 存在下三种角质酶的展开和灭活的比较分析。以前的研究主要关注茄腐皮镰刀菌 (FsC) 的角质酶。除 FsC 之外,本研究还包括特异腐质霉 (HiC) 和 HiC 的突变体 (μHiC) 的角质酶,其活性增加,表面活性剂敏感性降低。在水溶液和反胶束中研究 AOT 的平衡和时间分辨变性,并与 GdnHCl 变性进行比较。在两种变性剂的水溶液中获得的远紫外 CD 和荧光变性图谱对所有三种角质酶都吻合,表明在这些条件下展开是合作的双态过程。在反胶束中,角质酶以单指数速率展开,再次表明了双态过程。通过平衡数据的线性外推法计算水中变性的自由能,三种角质酶产生非常相似的值,对于 GdnHCl 和 AOT 分别为 -11.6kcal mol -1 和 -2.6kcal mol-1。因此,相对于水中的天然状态,AOT 变性状态 (DAOT) 比 GdnHCl 变性状态 (DGdnHCl) 更不稳定。远紫外 CD 光谱揭示 DAOT 保留一些二级结构,而 DGdnHCl 基本上是非结构化的。同样,荧光数据表明 DAOT 比 DGdnHCl 更紧凑。活性测量显示 DAOT 和 DGdnHCl 实际上是无活性的(催化活性 < 天然酶的 1%)。DAOT 在反胶束中的荧光光谱与在含水 AOT 中观察到的光谱没有显著差异。DAOT 在反胶束中的 NMR 研究表明,该结构是熔球的特征,与 CD 和荧光数据一致。© 2004 Elsevier B.V. 保留所有权利。


Von Ossowski, I.、Eaton, J.T.、Czjzek, M.、Perkins, S.J.、Frandsen, T.P.、Schülein, M.、Panine, P.、Henrissat, B.、Receveur-Bréchot, V.
“蛋白质障碍:柔性接头在嵌合双纤维素酶中的构象分布”
《生物物理学期刊 (Biophysical Journal)》,第 88 卷第 4 期,第 2823-2832 页。(2005)

摘要

已经通过小角度 X 射线散射研究了将纤维素结合模块连接到双模纤维素酶中催化模块的连接肽的结构特性。由于接头和纤维素结合模块相对较小且不能容易地单独检测,因此通过人工融合蛋白质 Cel6BA 研究接头的构象,其中 88 个残基的接头将特异腐质霉的纤维素酶 Cel6A 和 Cel6B 的较大催化模块连接起来。我们的数据显示 Cel6BA 伸长,最大尺寸为 178 A,但不能用单一构象进行描述。域间分离范围在 10 Å 到 130 Å 之间的一系列 Cel6BA 构象的模型表明,良好的 Guinier 和 P(r) 剖面拟合是通过所有模型的散射曲线加权平均得到的,其中接头遵循非随机分布,偏好更紧凑的构象。这些结构性质对于接头作为两个功能模块之间的分子弹簧的功能可能是必不可少的。因此,小角度的 X 射线散射提供了一种独特的工具来定量分析描述为天然展开的蛋白质典型构象障碍。© 2005 Biophysical Society 版权所有。


Maurus, R.、Begum, A.、Kuo, H.-H.、Racaza, A.、Numao, S.、Andersen, C.、Tams, J.W.、Vind, J.、Overall, C.M.、Withers, S.G.、Brayer, G.D.
“氯化物诱导的人胰腺 α-淀粉酶活化的结构和机理研究”
《蛋白质科学 (Protein Science)》,第 14 卷第 3 期,第 743-755 页。(2005)

摘要

已经通过结构和动力学实验研究了氯化物对 α-淀粉酶的变构活化机制,该实验注重人胰腺 α-淀粉酶 (HPA) 的氯化物依赖性 N298S 变体和氯化物非依赖性 TAKA-淀粉酶。HPA 变体的动力学分析清楚地表明了氯离子结合对反应速率的显著活化作用及其对催化作用 pH 依赖性的影响。在氯离子结合时,在 N298S 变体中观察到的结构改变表明氯离子发挥了促进催化的各种作用。其中之一是对酸/碱催化剂残留物 E233 的定位具有很强的影响。氯离子缺乏导致该残留物的多重构象和非预期酶产物。氯离子和 N298 也似乎稳定了多肽链的螺旋区域,从中可以预测氯化物依赖性 α-淀粉酶所特有的柔性底物结合环。该结构特征还用于正确定位催化剂必需的残留物 D300。比较分析表明,氯化物非依赖性 α-淀粉酶通过取代疏水核心来补偿结合氯的缺失,改变了底物相互作用的方式并改变了 N298 的位置。这些进化上的差异可能是出于对其他操作环境或特定产品特征中获得的优势的回应。试图将氯化物依赖性转化为氯化物非依赖性 TAKA-淀粉酶,指出了该系统的复杂性,以及许多因素在氯化物依赖性 α-淀粉酶中结合氯离子时发挥作用的事实。


Høyrup, P.、Callisen, T.H.、Jensen, M.Ø.、Halperin, A.、Mouritsen, O.G.
“脂质突起、膜柔软性和酶活性”
《物理化学化学物理 (Physical Chemistry Chemical Physics)》,第 6 卷第 7 期,第 1608-1615 页。(2004)

摘要

磷脂酶 A2 在脂双层上的活性显示出先前已经显示反映底物物理性质的特征滞后突发行为。目前尚不清楚何种潜在分子机制是造成这种现象的原因。我们在本文拟定单层脂质分子从双层平面突出可以提供这样的机制。该提议得到了原子尺度分子动力学模拟、理论和实验的共同支持,这些实验旨在研究两方面的关系,一方面是脂质突出模式和磷脂双分子层的机械柔软性,另一方面是作用于不同不饱和脂质组成的脂双层的酶活性。具体来说,我们的实验显示了双层弯曲刚度与从系统滞后时间与温度分析中提取的表观阿雷尼厄斯活化能之间的相关性。


H.L.Bagger;C.C.Fuglsang;P. Westh。(2003)
“两种相容的溶质优先结合到隔孢伏革菌植酸酶的聚糖基团”
《生物化学 (Biochemistry)》,第 42 卷,10295-10300 (2003)

摘要

已经表明调节水合行为以及对溶度和其他性质的伴随影响为蛋白质糖基化的主要功能。在这项工作中,我们研究了两种相容的溶质甘油和山梨糖醇溶液 (0.15-1.1 m) 中重糖苷化的隔孢伏革菌植酸酶的水合作用。渗透压测量显示甘油优先结合植酸酶(即,甘油糖蛋白相互作用比水-糖蛋白相互作用更有利,导致甘油在蛋白质界面附近优先蓄积),而山梨糖醇优先从水合球中排除(水-糖蛋白相互作用更有利)。为了分别评估来自碳水化合物和肽基团的贡献,我们比较了植酸酶 (Phy) 和已经去除 90% 聚糖的已修饰但尚有酶活性的形式 (dgPhy)。这显示两种多羟基化合物均表现出与碳水化合物基团优先结合的显著和近似相等的程度。多羟基化合物与聚糖的这种优先结合与此处观察到的(对于 dgPhy)和以前关于非糖基化蛋白质的许多报告中的肽界面排除不同。尽管肽和碳水化合物基团之间有明显的差异,但糖基化对甘油和山梨糖醇提供的稳定作用没有影响。在此基础上得出的结论是,Phy 的碳水化合物外层在天然和热变性状态下是同等可接近的(最有可能在两者中均完全可接近),因此它与相容溶质的相互作用对糖蛋白的构象平衡影响极小或没有影响。另一方面,对于溶度和聚集平衡,结果表明多羟基化合物诱导单体形式的稳定化。


A.D. Nielsen;C.C.Fuglsang;P. Westh。
“钙离子对重组盐敏芽孢杆菌 α-淀粉酶不可逆变性的影响:量热研究。”
《生物化学杂志 (Biochem.J.)》,第 373 卷,337-343 (2003)

摘要

已经使用量热法研究了温度和钙离子对来自盐敏芽孢杆菌 á-淀粉酶 (BHA) 的重组 á-淀粉酶变性的影响。发现 BHA 的热失活具有不可逆性,并且钙离子对稳定性具有显著影响。因此,在存在过量钙离子的情况下,观察到 83 °C 的表观变性温度 (Td),而当去除钙时,Td 降低至 48 °C。在使用和不使用钙离子情况下的热稳定性差异已被用于开发等温滴定量热 (ITC) 程序,该程序允许同时测定钙消耗 BHA 变性的动力学参数和焓变。发现钙消耗 BHA 的变性的活化能 EA 为 101 kJ/mol。结果支持动力学变性机制,其中钙消耗淀粉酶在低温下不可逆变性,并且如果钙离子过量,则淀粉酶在高温下不可逆变性。两个变性反应与钙结合和钙消耗淀粉酶之间的钙结合平衡相偶联。通过等温滴定量热法测定的动力学变性结果和钙结合常数的组合用于估计动力学稳定性,以 BHA 的半衰期作为温度和游离钙离子浓度的函数进行表示。因此,通过增加游离钙浓度,估计表观 EA 可以增加到约 123 kJ/mol。


A.D. Nielsen;M.L.Pusey;C.C.Fuglsang;P. Westh。
“重组盐敏芽孢杆菌 α-淀粉酶的拟定热变性机制 - 钙离子的影响”
《生物化学与生物物理学报 (Biochim.Biophys.Acta.)》,第 1652 卷,52-63 (2003)

摘要

已经使用圆二色光谱 (CD) 和差示扫描量热法 (DSC) 研究了来自盐敏芽孢杆菌 α-淀粉酶 (BHA) 的重组 α-淀粉酶的热稳定性。这种 α-淀粉酶与其他芽孢杆菌 α-淀粉酶同源,其中结晶学研究已经鉴定了结构中存在三个钙结合位点。BHA 的变性不可逆, T-m 约为 89 摄氏度,DSC 热分析图可使用一步不可逆模型描述。观察到在存在 10 倍过量 CaCl2 的情况下 T-m 增加 5 摄氏度。然而,也观察到聚集倾向的伴随增加。存在 30-40 倍过量钙螯合剂(乙二胺四乙酸 (EDTA) 或乙二醇-双[β-氨基乙醚] N、N、N'、N'-四乙酸 (EGTA))导致 BHA 出现较大不稳定情况,相当于由 CD 和 DSC 两者测定的约低 40 摄氏度的 Tm。10 倍过量的 EGTA 揭示了对应于可逆和不可逆转变的复合 DSC 热分析图,其可能起源于不同群体的 BHA/钙复合物。这些观察结果和关于同源 α-淀粉酶的结构信息的组合解释形成了建立 BHA 失活机制的建议机制基础。该机制包括不同 BHA/钙复合物的不可逆热变性和钙结合平衡。此外,该模型解释了与钙结合有关的温度诱导的可逆结构变化。


F. Xu;E.J.Golightly;K.R.Duke;S.F.Lassen;B. Knusen;S. Christensen;K.M.Brown;S.H.Brown;M. Schulein.
“特异腐质霉纤维二糖脱氢酶:克隆、氧化还原化学和‘逻辑门’类双重功能”
《酶与微生物科技 (Enzyme and Microbial Technology)》,第 28 卷第 9-10 期,744-753 (2001)

摘要

纤维二糖脱氢酶是一种血红素氧化酶,其催化电子供给底物(例如纤维二糖)到黄素中心的序列电子转移,然后在从黄素到血红素的内部电子传递之后直接或通过血红素中心转移到电子接受底物(例如醌)。我们克隆了特异腐质霉的脱氢酶,其编码 761 个氨基酸残基的蛋白质,含有 N-末端血红素结构域和 C-末端 Ravin 结构域,并且研究了如何调节催化的电子转移。基于速率和氧化还原电位之间的相关性,我们证明随着黄素中心减少,作为还原酶的酶可以通过“外球”机制从其血红素中心输出电子。然而,伴随黄素中心“休息”,酶可以有一个类似过氧化物酶的功能,在过氧化活化后输入电子到其血红素中心。其血红素中心的双重功能使酶成为一个分子“逻辑门”,其中流经血红素中心的电子可以通过偶联的黄素中心的氧化还原状态转换方向。


C.C.Fuglsang;R.M.Berka;J.A.Wahleithner;S. Kauppinen;J.R.Shuster;G. Rasmussen;T. Halkier,;H. Dalbøge B. Henrissat。
“重组真菌非水溶性葡聚糖酶的生化分析。”
《生物化学杂志 (J. Biol. Chem.)》,第 275 卷,2009-2018 (2000)

摘要

核苷酸序列分析显示,哈茨木霉和产紫青霉的 1,3-葡聚糖酶(齿斑葡聚糖酶)具有同源一级结构(53% 氨基酸序列同一性),并由两个不同的结构域组成:NH2 末端催化结构域和推定的 COOH 末端多糖结合结构域,被 O-糖基化的 Pro-Ser-Thr 富集接头肽分开。在强淀粉酶基因启动子的转录调控下,米曲霉宿主中表达每种齿斑葡聚糖酶。纯化的重组齿斑葡聚糖酶在 pH 3.5 至 4.5 的范围内表现出最佳的 pH,并且在 pH 5.5 下表现出约 50-55 °C 的最佳温度。此外,它们分别表现出与不溶性齿斑葡聚糖的强结合,对于产紫青霉和哈茨木霉变齿酶,在 pH 7 下,KD 分别约为 0.11 和 0.13°M。部分水解表明,哈茨木霉的 COOH 末端结构域与变聚糖结合。催化结构域和结合结构域被分别分配到一个新的糖苷水解酶家族和一个新的碳水化合物结合结构域家族。