Damien Farrell、Helen Webb、Michael A. Johnston、Thomas A. Poulsen、Fergal O’Meara、Lars L. H. Christensen、Lars Beier、Torben V. Borchert 和 Jens Erik Nielsen
《生物化学 (Biochemistry)》,2012,第 51 卷第 26 期,第 5339–5347 页
DOI:10.1021/bi201926f
发表日期 (Web):2012 年 6 月 6 日
版权所有 © 2012 American Chemical Society

摘要

迈向快速测定蛋白质稳定性图谱:拟诺卡氏菌丝氨酸蛋白酶突变体的实验和理论分析
丝氨酸蛋白酶的稳定性对其在工业过程中的应用非常重要。在这里,我们对包含多个点突变的 121 个微纯化突变酶克隆使用快速残留活性试验、特征分类算法和基于结构的能量计算算法,研究拟诺卡氏菌丝氨酸蛋白酶的稳定性的决定因素。使用多元回归分析,我们对突变克隆的数据进行去卷积,发现残基 Asn47 和 Pro124 的突变对酶的稳定性是有害的。这两个残基均位于已知对于高度同源的 α-裂解蛋白酶的稳定性重要的环中。PEATSA 基于结构的能量计算显示出与实验测量值的趋势具有良好的总体一致性,但也确定了算法未能正确预测的克隆数量。我们讨论了与密切相关蛋白酶的结构和功能有关的结果的意义,评价了进行高通量实验以表征蛋白质稳定性决定因素时的最佳实验设计,并利用复杂的数据集讨论了基于结构的能量计算的表现,例如本文中提供的数据集。

 

Jones, A.、Lamsa, M.、Frandsen, T.P.、Spendler, T.、Harris, P.、Sloma, A.、Xu, F.、Nielsen, J.B.、Cherry, J.R.
“定向进化芽孢杆菌 TS-25 产麦芽糖 α-淀粉酶”
《生物技术杂志 (Journal of Biotechnology)》,第 134 卷第 3-4 期,第 325 - 333 页。(2008)

摘要

定向进化结合高通量的机器人屏幕被用来拓宽芽孢杆菌 TS-25 产麦芽糖 α-淀粉酶 Novamyl 的工业用途。野生型 Novamyl 目前用于烘焙行业,作为在中性或接近中性 pH 下烘焙面包中的抗老化剂。然而,在用低 pH 值食谱制作面包的烘焙过程中,酶迅速失活,因此 Novamyl 对这种特殊应用具有非常有限的有益效果。为了改进 Novamyl 对低 pH 值面包应用(例如酸面团和黑麦)的性能,在枯草芽孢杆菌中产生和表达两个易错的 PCR 文库,并筛选出在低 pH 条件下具有改进热稳定性和活性的变体。表现出改进性能的变体使用 DNA 改组反复重组以产生两代文库。相对于野生型 Novamyl,许多得到的变体在 pH 4.5 时显示出超过 10 °C 的热稳定性增加,其中一个在低 pH 值面包中表现出相当大的抗老化性质。© 2008 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Blanchard, S.、Armand, S.、Couthino, P.、Patkar, S.、Vind, J.、Samain, E.、Driguez, H.、Cottaz, S.
“特异腐质霉 Cel7B 糖苷合酶突变体的意外区域选择性”
《碳水化合物研究 (Carbohydrate Research)》,第 342 卷第 5 期,第 710-716 页。(2007)

摘要

评估了四种特异腐质霉 Cel7B 糖苷水解酶突变体用于在 O-烯丙基 NI-乙酰基-2II-叠氮基-β-壳聚糖苷上偶联乳酰基氟。双突变体 Cel7B E197A H209A 和 Cel7B E197A H209G 优先催化两个双糖之间形成 β-(1→4) 连接,而单突变体 Cel7B E197A 和三重突变体 Cel7B E197A H209A A211T 主要产生 β-(1→3) 连接的四糖。这个结果构成了通过对内切糖合酶进行定点诱变来调节区域选择性的首次报告。© 2007 Elsevier Ltd. 保留所有权利。

 

Blanchard, S.、Cottaz, S.、Coutinho, P.M.、Patkar, S.、Vind, J.、Boer, H.、Koivula, A.、Driguez, H.、Armand, S.
“真菌内切葡聚糖酶突变为糖苷合成酶并表征其受体底物特异性”《分子催化杂志 B:酶 (Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic)》,第 44 卷第 3-4 期,第 106-116 页。(2007)

摘要

特异腐质霉突变体 Cel7B E197A 是一种功能强大的内切糖苷合成酶,显示受体底物特异性在 +1 亚位限于 β-d-葡萄糖基、β-d-木糖基、β-d-甘露糖基和 β-d-葡糖胺基。我们的目标是将此底物特异性扩展到 β-d-N-乙酰葡糖胺基,以获取通过糖苷合成辅助合成获得的更广泛寡糖结构。在第一种方法中,带有 β-d-N-乙酰葡糖胺基残基的三糖对接于特异腐质霉 Cel7B 的 +1 亚位,表明只有一个残基 His209 的突变可能导致预期的更宽受体特异性。在米曲霉中产生和表达三种特异腐质霉 Cel7B 糖苷合酶突变体(H209A、H209G 和 H209A/A211T)。同时,序列比对研究显示来自 GH7 家族的几种纤维素酶在位置 209 处显示丙氨酸残基而不是组氨酸。其中,作为一种与腐质霉属 Cel7B 共同具有最高序列识别程度的内切葡聚糖酶,里氏木霉 Cel7B 被发现天然地接受 +1 亚位的 β-d-N-乙酰葡糖胺基残基。在酿酒酵母中生产和表达里氏木霉 Cel7B 突变亲核体 E196A,并且针对各种糖苷受体,将其作为糖苷合酶的活性与特异腐质霉糖苷合酶突变体一起进行评估。© 2006 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Eijsink, V.G.H.、GÅseidnes, S.、Borchert, T.V.、Van Den Burg, B.
“定向进化酶的稳定性”
《生物分子工程 (Biomolecular Engineering)》,第 22 卷第 1-3 期,第 21-30 页。(2005)

摘要

现代酶的开发越来越依赖于基于多样性生成,然后筛选具有优化性质的变体的策略。在原则上,这些定向进化策略可以用于优化任何酶性质,即使该性质的分子基础未知,也可以经济可行的方式进行筛选。稳定性是酶的一个有趣性质,因为 (1) 具有重要的工业意义,(2) 相对容易筛选,(3) 稳定性的分子基础与蛋白质科学中的当代问题密切相关,如蛋白质折叠问题和蛋白质折叠疾病。因此,工程酶的稳定性具有商业价值和科学价值。在这里,我们回顾了定向进化如何促成了稳定酶的开发和对蛋白质稳定性原理的新认识。文中描述了最近的数个示例。这些示例表明定向进化是获得稳定酶的有效策略,特别是与理性或半理性工程策略结合使用时。关于蛋白质稳定性的原理,从近期定向进化的研究中学到的一些重要经验是:(1) 用于稳定蛋白质的结构性方法有许多,并不总是容易合理化;(2) 蛋白质可能通过优化其表面来很好地加以稳定,以及 (3) 可以获得较高的热稳定性,低温下不丧失催化性能。© 2005 Elsevier B.V. 保留所有权利。

 

Tindbaek, N.、Svendsen, A.、Oestergaard, P.R.、Draborg, H.
“特定底物的冷适应性枯草杆菌蛋白酶工程”
《蛋白质工程,设计与选择 (Protein Engineering, Design and Selection)》,第 17 卷第 2 期,第 149-156 页。(2004)

摘要

预测嗜冷酶 TA39 枯草杆菌蛋白酶 (S39) 的一个区域被 in silico 转移至迟缓芽孢杆菌 (clausii) 的嗜温性枯草杆菌蛋白酶,即赛威蛋白酶 (EC 3.4.21.62)中。工程杂交种和赛威蛋白酶最初是由分子动力学模拟在 300 K 下研究显示结合区域和全局灵活性。预测的 S39 区域由 12 个残基组成,由于枯草杆菌蛋白酶之间的同源性,导致总共 8 个残基发生变化。通过定点修饰,将该区域转移至赛威蛋白酶的结合区域,从而构建了赛威蛋白酶-S39 杂交种,命名为 H5。设计的杂交种具有与赛威蛋白酶相同的温度和 pH 谱,但 H5 在所有测量的温度下在合成底物 N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺 (AAPF) 上具有较高的特异性活性,同时 H5 显示热稳定性下降。与赛威蛋白酶(N-琥珀酰-XXXX-pNA;XXXX = AAPF、AAPA 和 FAAF)相比,由于在 AAPF、AAPA 和 FAAF 上的催化效率增加,在室温下测量 H5 杂交体显示出更宽的底物特异性。通过分子动力学模拟研究,H5 杂交体显示在低温下活性增加,结合区域和全局灵活性增加,差示扫描量热法测量显示全局不稳定性。这些嗜冷特性表明结合位点的灵活性增加,可能是由于修饰 P129S、S130G、P131E,因此我们表明可以通过结合区域中的工程灵活性来增加低温活性和全局灵活性。

 

M. Schulein。
“纤维素酶的蛋白工程”
《生物化学与生物物理学报-蛋白质结构与分子酶学 (Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology)》,第 1543 卷第2 期,239-252 (2000)

摘要

纤维素酶是水解纤维素的 β-1,4- 糖苷键的酶。它们属于通过序列分析识别的 82 个糖苷水解酶家族中的 13 个,但是它们在传统上分为两类,称为“内切葡聚糖酶”(EC 3.2.1.4) 和“纤维二糖水解酶”(3.2.1.91)。两种类型的纤维素酶降解可溶性纤维糊精和无定形纤维素,但是除了一些显着的例外情况,能够高效地降解结晶纤维素的只有纤维二糖水解酶。定点突变一直是纤维素酶表征的核心,从推定的催化和结合残基的识别和表征,通过晶体学捕获酶-底物复合物,到构建新的和改进的生物催化剂(包括“糖苷合成酶”)。尽管对可溶性底物和底物类似物的研究提供了大量信息,但了解结晶纤维素这种天然底物的降解机制仍然是一项巨大的挑战。

 

F. Xu;A.E.Palmer;D.S.Yaver;R.M.Berka;G.A.Gambetta;S.H.Brown;E.I.Solomon。
“长绒毛栓菌漆酶中的靶向突变:T1 铜的轴向扰动”
《生物化学杂志 (J. Biol. Chem.)》,274,12372-12375 (1999)

摘要

长绒毛栓菌漆酶在靠近 1 型位点的四肽片段上发生突变。突变 F463M 和 F463L 位于对应于西葫芦抗坏血酸氧化酶中 1 型铜轴蛋氨酸 (M517) 配体的位置。突变 E460S 和 A461E 靠近 T1 铜位点。突变的栓菌属漆酶在米曲霉宿主中表达并表征。E460S 突变未能产生带有意义表达的转化体。F463L 和 A461E 突变未显着改变漆酶的分子和酶学性质。相反,F463M 突变导致 1 型铜位点,EPR 信号中间体介于野生型漆酶和质体蓝素之间,紫外可见光谱改变,且氧化还原电位降低 (0.1 V)。在氧化酚类底物中,突变导致最佳 pH 碱性增强以及 kcat 和 Km 增加。这些影响归因于由轴向甲硫氨酸 (M463) 配体的配位引起的 T1 铜中心的显著扰动。

 

F. Xu;R.M.Berka;J.A.Wahleithner;B.A.Nelson;J.R.Shuster;S.H.Brown;A.E.Palmer;E.I.Solomon。
“真菌漆酶中的定点突变:对氧化还原电位、活性和 pH 谱的影响”
《生物化学杂志 (Biochem.J.)》,334,63-70 (1998)

摘要

嗜热毁丝霉属漆酶和立枯丝核菌漆酶在认为靠近 1 型 Cu 位点的五肽片段上发生突变。毁丝霉属漆酶中的突变 L513F 和丝核菌漆酶中的 L470F 突变发生在对应于西葫芦抗坏血酸氧化酶中的 1 型 Cu 轴向甲硫氨酸 (M517) 配体的位置上。毁丝霉属漆酶中的三重突变 V509L、S510E、G511A 和丝核菌漆酶中的 L466V、E467S、A468G 涉及一个序列片段,其在抗坏血酸氧化酶中的同源物侧翼为 M517 和 1 型 Cu 连接组氨酸 (H512)。单一突变没有产生酶性质的显著变化(包括 1 型 Cu 的氧化还原电位的任何显著增加)。相反,三重突变导致了几个显著的变化。与野生型相比,丝核菌和毁丝霉属漆酶三重突变体具有苯酚氧化酶活性,其最佳 pH 分别向上和向下移动 1 个单位。尽管氧化还原电位没有发生显著改变,漆酶的 Km、kcat 和氟化物抑制作用由于突变而显著改变。观察到的效应被解释为可能由于突变引起的对还原底物和漆酶之间的分子识别以及从底物至 1 型 Cu 中心的电子转移的结构波动。