Reichwald, K., Hatzack, F.
“Application of a modified Haug and Lantzsch method for the rapid and accurate photometrical phytate determination in soybean, wheat, and maize meals”
(Aplicación de un método modificado de Haug y Lantzsch para la determinación fotométrica rápida y precisa de fitatos en alimentos de soja, trigo y maíz). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (9), págs. 2888-2891. (2008)

Resumen

Se aplicó una versión modificada del método de Haug y Lantzsch para la determinación fotométrica rápida de fitatos en alimentos de soja, trigo y maíz. En comparación con el protocolo original, se reduce sustancialmente la cantidad del reactivo tóxico ácido tioglicólico para minimizar los posibles riesgos de salud del personal de laboratorio. Se analizaron diferentes condiciones de extracción para los alimentos de soja, y se halló que fue necesario hervir durante al menos 30 min para eliminar un componente de interferencia en los extractos de alimentos de soja. El contenido de fitatos determinado a través del método modificado de Haug y Lantzsch no difirió del contenido que se obtuvo a través de la medición del fósforo total precipitado o mediante cromatografía iónica de alta resolución específica y sensible. Se demostró la aplicabilidad y precisión del método modificado para el análisis de fitatos en sustratos de alimentos importantes, incluso la proteína vegetal texturizada de soja. © 2008 American Chemical Society.

 

Olesen, K.-M., Hansen, S.H., Sidenius, U., Schmiegelow, K.
“Determination of leukocyte DNA 6-thioguanine nucleotide levels by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection”
(Determinación de los niveles de nucleótidos de la 6-tioguanina del ADN en leucocitos mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección por fluorescencia). Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 864 (1-2), págs. 149-155. (2008)

Resumen

Se desarrolló un método de HPLC para la determinación de nucleótidos de 6-tioguanina en el ADN. Se aisló el ADN de leucocitos de sangre periférica derivada con cloroacetaldehído, y los derivados de eteno formados N2,3-eteno 6-tioguanina (ε6TG), 1,N6-eteno adenina (εA) y N2,3-eteno guanina (εG) se liberaron del esqueleto del ADN mediante hidrólisis con un pH de 6,0 y 80 °C durante 60 min. Después de la extracción de ε6TG mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC), la muestra se analizó mediante HPLC de pares iónicos en fase inversa con detección por fluorescencia. El límite de cuantificación fue 9,0 nM y la precisión intradiaria e interdiaria osciló de 2,8 a 15,5 %. En una cohorte pequeña de ocho niños con leucemia linfoblástica aguda (acute lymphoblastic leukaemia, ALL), se halló una mediana de una base de 6-tioguanina para cada una de las 3000 bases normales (rango 1:2000-1:11000). © 2008 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Gizzi, G., Thyregod, P., Von Holst, C., Bertin, G., Vogel, K., Faurschou-Isaksen, M., Betz, R., Murphy, R., Andersen, B.B.
“Determination of phytase activity in feed: interlaboratory study”
(Determinación de la actividad de las fitasas en los alimentos: estudio entre laboratorios). Journal of AOAC International, 91 (2), págs. 259-267. (2008)

Resumen

Se llevó a cabo un estudio entre laboratorios con el fin de terminar las características de rendimiento de un método nuevo para determinar la actividad de las fitasas en muestras de alimentos. El método se basa en el principio de que el fosfato inorgánico se libera del fitato de sustratos en condiciones analíticas definidas, y se ha validado debido a su idoneidad para medir la actividad enzimática de diversos productos con fitasa. Se aplicaron dos diseños experimentales diferentes de estudio, lo que permitió calcular la precisión del método en condiciones de repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad, respectivamente. La desviación estándar relativa (DER) de la repetibilidad osciló de 2,2 a 10,6 %, y la DER de la reproducibilidad osciló de 5,4 a 15 %. Se demostró la idoneidad del método validado para el propósito previsto. El perfil de rendimiento obtenido del método validado en este estudio fue comparable con el perfil de métodos similares que se validaron exclusivamente para un producto con fitasas.

 

Zarnkow, M., Mauch, A., Back, W., Arendt, E.K., Kreisz, S.
“Proso millet (Panicum miliaceum L.): An evaluation of the microstructural changes in the endosperm during the malting process by using scanning-electron and confocal laser microscopy”
(Mijo común [Panicum miliaceum L.]: una evaluación de los cambios microestructurales en el endospermo durante el proceso de malteado mediante microscopía electrónica de barrido y microscopía láser confocal). Journal of the Institute of Brewing, 113 (4), págs. 355-364. (2007)

Resumen

Se utilizaron microscopía electrónica de barrido (scanning electron microscopy, SEM) y microscopía láser confocal (confocal laser scanning microscopy, CLSM) para investigar los cambios microestructurales en el endospermo durante el proceso de malteado. La SEM fue una herramienta adecuada para caracterizar la constitución microestructural de los gránulos de almidón en el mijo común, y los cambios que ocurren durante el malteado. Se pudo observar una degradación visible temprana (después de 24 h) de los gránulos de almidón ubicados en el endospermo farináceo, el cual está cerca del embrión. Debido a esta degradación, se observó un empaquetamiento menos denso de esta parte del endospermo a través de la microscopía láser confocal. La degradación de los gránulos de almidón en el endospermo vítreo fue evidente en una etapa posterior distintiva del malteado (78 h), y se detectó un ataque preferente de los gránulos pequeños (<2,5 μm). Los cambios en la estructura proteica no se pudieron detectar por SEM ni CLSM. © 2007 The Institute of Brewing & Distilling.

 

Poulsen, L.K., Pedersen, M.H., Dufva, M.
“Allergology on a chip”
(Alergología en un chip). Clinical and Experimental Allergy, 37 (12), págs. 1736-1737. (2007)

Kim, K.-H., Brown, K.M., Harris, P.V., Langston, J.A., Cherry, J.R.
“A proteomics strategy to discover β-glucosidases from Aspergillus fumigatus with two-dimensional page in-gel activity assay and tandem mass spectrometry”
(Una estrategia proteómica para descrubrir β-glucosidasas de Aspergillus fumigatus con una valoración de actividad mediante electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida y espectrometría de masas en tándem). Journal of Proteome Research, 6 (12), págs. 4749-4757. (2007)

Resumen

La producción económicamente competitiva de etanol a partir de biomasa lignocelulósica mediante hidrólisis enzimática y fermentación se encuentra limitada actualmente, en parte debido al costo relativamente alto y la baja eficiencia de las enzimas requeridas para hidrolizar la celulosa de azúcares fermentables. El descubrimiento de celulasas novedosas con mayor actividad podría ser un paso crítico para superar este obstáculo relacionado con los costos. β-glucosidasa cataliza el paso final al convertir los polímeros de glucosa en glucosa. A pesar de la importancia, solo existen unas pocas β-glucosidasas disponibles a nivel comercial, y es evidente que se necesitan otras más eficientes. Desarrollamos una estrategia proteómica para descubrir las β-glucosidasas presentes en el proteoma secretado del hongo que degrada la celulosa, Aspergillus fumigatus. Con el uso de condiciones parciales o completas de desnaturalización de proteínas, el proteoma de secreción se fraccionó en un formato 2DGE, y se detectó la actividad de la β-glucosidasa en el gel después de la infusión con un sustrato análogo que puede fluorescer con la hidrólisis. Los puntos fluorescentes se sometieron a digestión tríptica, y se confirmó la identificación como β-glucosidasas mediante espectrometría de masas en tándem. Se identificaron dos β-glucosidasas novedosas de A. fumigatus mediante este método de tinción de actividad in situ, y se clonó el gen que codifica para una β-glucosidasa novedosa (EAL88289), el cual se expresó de manera heteróloga. La β-glucosidasa expresada mostró mucha más termoestabilidad que las β-glucosidasas de Aspergillus niger y Aspergillus oryzae caracterizadas anteriormente. La mejora en la termoestabilidad es importante para el desarrollo de la próxima generación de enzimas de sacarificación capaces de desencadenar rápidas reacciones de hidrólisis de la celulosa a temperaturas elevadas y, por lo tanto, disminuir el costo de la producción de bioetanol. El método de tinción de actividad in situ aquí descrito sería una herramienta útil para catalogar y evaluar la eficiencia de las β-glucosidasas con un rendimiento alto. © 2007 American Chemical Society.

 

Råvik, M., Cimander, C., Elofsson, U., Veide, A.
“A method for microbial cell surface fingerprinting based on surface plasmon resonance”
(Un método para determinar la huella de la superficie celular microbiana basado en la resonancia de plasmones superficiales). Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70 (4), págs. 595-604. (2007)

Resumen

Se propone un método para determinar la huella de la superficie celular microbiana utilizando la resonancia de plasmones superficiales (surface plasmon resonance, SPR). Se han utilizando cuatro mutantes diferentes de Escherichia coli como células modelo. Las huellas de la superficie celular se generaron mediante el registro de la interacción entre los mutantes celulares y cuatro superficies diferentes, con propiedades físicas y químicas distintas, cuando una suspensión celular se fluidizó encima de la superficie. Se observaron diferencias significativas en el patrón de huella entre algunos de los mutantes. Al mismo tiempo, se determinaron las propiedades físicas de las superficies celulares utilizando microelectroforesis, mediciones del ángulo de contacto y partición acuosa en dos fases, y se compararon con las huellas obtenidas por SPR. Las huellas de la superficie celular generadas y los datos sobre las propiedades físicas se evaluaron a través de un análisis multifactorial de datos que mostró que las células estaban separadas en grupos individuales de una forma similar utilizando gráficos de análisis de componentes principales (principal component analysis, PCA). © 2007 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Haack, M.B., Lantz, A.E., Mortensen, P.P., Olsson, L.
“Chemometric analysis of in-line multi-wavelength fluorescence measurements obtained during cultivations with a lipase producing Aspergillus oryzae strain”
(Análisis de quimiometría de las mediciones de fluorescencia de múltiples longitudes de onda en línea obtenidas durante los cultivos con una lipasa que produce una cepa de Aspergillus oryzae). Biotechnology and Bioengineering, 96 (5), págs. 904-913. (2007)

Resumen

Se cultivó el hongo filamentoso Aspergillus oryzae en régimen discontinuo y en régimen discontinuo con alimentación con el fin de investigar el uso de fluorescencia con múltiples longitudes de onda para supervisar la actividad durante los cultivos de hongos filamentosos. La cepa de A. oryzae aplicada expresó una lipasa fúngica a partir de Thermomyces lanuginosus. Los espectros de fluorescencia con múltiples longitudes de onda se recogieron cada 5 min con el sistema Bio View® (DELTA, Dinamarca), y se construyó tanto un modelo de exploración como uno de predicción para correlacionar los datos de fluorescencia con la masa celular y la actividad de la lipasa. Durante los cultivos, A. oryzae mostró crecimiento disperso de las hifas y, en estas condiciones, no se observó suciedad en el sensor de fluorescencia de múltiples longitudes de onda. Los resultados del modelo de análisis factorial paralelo (parallel factor analysis, PARAFAC) basado en el espectro de fluorescencia ofrecieron pruebas claras de, por ejemplo, el inicio de la fase de alimentación. Los modelos predictivos que calcularon la masa celular mostraron correlaciones entre 0,73 y 0,97 con el error cuadrático medio de los resultados de la validación cruzada (root mean square error of cross validation, RMSECV) entre 1,48 y 0,77 g kg-1. También se construyó un modelo para calcular la actividad de la lipasa para los cultivos en régimen discontinuo con alimentación con una correlación de 0,93. Los resultados que aquí se presentan muestran claramente que la fluorescencia de múltiples longitudes de onda es una herramienta útil para controlar los cultivos en régimen discontinuo con alimentación de los hongos filamentosos. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.

 

Sonesson, A.W., Callisen, T.H., Brismar, H., Elofsson, U.M.
“A comparison between dual polarization interferometry (DPI) and surface plasmon resonance (SPR) for protein adsorption studies”
(Una comparación entre la interferometría de polarización dual (DPI) y la resonancia de plasmones superficiales (SPR) para los estudios de adsorción de proteínas). Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 54 (2), págs. 236-240. (2007)

Resumen

Este trabajo se realizó con el objetivo de comparar los resultados de adsorción de proteínas obtenidos de la interferometría de polarización dual (dual polarization interferometry, DPI) desarrollada recientemente con la ya conocida técnica de resonancia de plasmones superificiales (surface plasmon resonance, SPR). Ambas técnicas utilizan un campo evanescente como el elemento de detección, pero métodos completamente diferentes para calcular la masa adsorbida. Utilizamos como sistema de prueba la adsorción de la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL) en superficies C18. Las cantidades adsorbidas calculadas con ambas técnicas concuerdan de manera aceptable, y ambas líneas isotermas de adsorción se saturaron a 1,30-1,35 mg/m2 con concentraciones de TLL de 1000 nM y más. Por lo tanto, esto sustenta el uso de SPR y DPI como herramientas para estudiar la adsorción de proteínas, la cual es muy importante al comparar los datos de adsorción obtenidos a través de las diferentes técnicas. Debido a la detección punto sensible en SPR, esta técnica se recomienda para los estudios iniciales de cinética, en tanto DPI es más exacto cuando el índice de refracción y la densidad de la capa adsorbida resultan de mayor interés. © 2006 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

Houmøller, L.P., Kristensen, D., Rosager, H.
“Determination of SFC, FFA, and equivalent reaction time for enzymatically interestified oils using NIRS”
(Determinación de SFC, FFA, y tiempo de reacción equivalente para aceites con interesterificación enzimática utilizando NIRS). Talanta, 71 (2), págs. 868-873. (2007)

Resumen

Se investigó el uso de la espectroscopia en el infrarrojo cercano (near infrared spectroscopy, NIRS) para la determinación rápida del grado de interesterificación de las mezclas de estearina de palma, aceite de coco y aceite de colza obtenidas a través de una lipasa de Thermomyces lanuginosa inmovilizada a 70 °C. La interesterificación se llevó a cabo aplicando reactores de lecho fijo y en régimen discontinuo. Se desarrollaron las calibraciones para la determinación cuantitativa del contenido de grasa sólida (solid fat content, SFC) a 10, 20, 30, 35, y 40 °C y ácidos grasos libres (free fatty acid, FFA) que provocaron errores medios cuadráticos de predicción de 1,0; 1,3; 1,4; 1,6; 1,7 y 0,19 % (p/p), respectivamente. Los datos mostraron que NIRS se podía utilizar para reemplazar los métodos tradicionales para determinar FFA y SFC en aceites vegetales. Fue posible controlar la actividad de la enzima inmovilizada para la interesterificación de aceites de margarina prediciendo el tiempo de reacción equivalente en un reactor en régimen discontinuo del espectro NIR. Los errores cuadráticos medios de predicción para dos mezclas diferentes de aceites con interesterificación durante 300 y 170 min fueron 21 y 12 min, respectivamente. © 2006 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F.
“Analysis of phosphorus and phosphorylated compounds in the context of plant physiology and global phosphorus management: A review”
(Análisis del fósforo y los compuestos fosforilados en el contexto de la fisiología vegetal y la regulación del fósforo a nivel global: una revisión). Current Analytical Chemistry, 2 (4), págs. 421-430. (2006)

Resumen

El control del fósforo (P) como un recurso no renovable está recibiendo cada vez más atención en los albores del nuevo milenio. La importancia del fosfato como nutriente, la carga de fosfato en el medioambiente en áreas con producción intensiva de ganado y el agotamiento de recursos de fosfato de alta calidad acentúan la necesidad de regular los recursos fosfóricos de una manera holísitica y global, y exigen comprender los roles fisiológicos, la biosíntesis y la descomposición de los compuestos fosforilados en las plantas. Dos vías importantes para una mejor regulación de los recursos fosfóricos son la ingeniería genética de plantas para una mejor biodisponibilidad de fósforo, y la aplicación de fitasas microbianas para aumentar la biodisponibilidad de fósforo en forma de fitato en los animales monográstricos. La presente revisión ofrece un descripción general de estos métodos de regulación del fósforo y explica la cantidad de técnicas analíticas que se pueden utilizar para analizar el fósforo y los compuestos fosforilados. Esta capacidad analítica es un determinante importante en el desarrollo de métodos más avanzados y efectivos para el control de los recursos fosfóricos. © 2006 Bentham Science Publishers Ltd.

 

Mejlhede, N., Kyjovska, Z., Backes, G., Burhenne, K., Rasmussen, S.K., Jahoor, A.
“EcoTILLING for the identification of allelic variation in the powdery mildew resistance genes mlo and Mla of barley”
(EcoTILLING para la identificación de la variación alélica en los genes de resistencia del moho polvoriento mlo y Mla de la cebada). Plant Breeding, 125 (5), págs. 461-467. (2006)

Resumen

En esta investigación se describe la implementación exitosa de una técnica de detección de mutaciones basada en CEL I para el descubrimiento y la detección del polimorfismo del ADN de los genes mlo y Mla de la cebada. La técnica se denomina EcoTILLING, y se trata de un método de alto rendimiento para detectar y descubrir nuevas mutaciones puntuales e inserciones/eliminaciones pequeñas en el ADN. Se demuestra que el método no solo revela el polimorfismo entre diferentes alelos, sino que también se puede utilizar como un poderoso marcador genético. Los genes mlo y Mla participan en la defensa de la cebada contra el hongo polvoriento patógeno fúngico. El gen de resistencia del moho polvoriento mlo es un gen de copia única, en tanto existen múltiples alelos en el locus de Mla. EcoTILLING permitió identificar las mutaciones puntuales y las eliminaciones en cada uno de los 11 mutantes de mlo evaluados. Se evaluaron 25 variantes de cebada natural para Mla, y aunque la identificación fue compleja debido a la presencia de parálogos de Mla muy similares, se logró identificar a la mayoría de los alelos identificados recientemente de la subespecie spontaneum de Hordeum vulgare. Este método ofrece la posibilidad de combinar diferentes alelos de mlo con diferentes alelos de Mla de la cebada silvestre para obtener cultivos con una resistencia más duradera. © 2006 The Authors.

 

Jürgen, B., Barken, K.B., Tobisch, S., Pioch, D., Wümpelmann, M., Hecker, M., Schweder, T.
“Application of an electric DNA-chip for the expression analysis of bioprocess-relevant marker genes of Bacillus subtilis”
(Aplicación de un chip de ADN eléctrico para el análisis de expresión de los genes marcadores de Bacillus subtilis relevantes para los bioprocesos). Biotechnology and Bioengineering, 92 (3), págs. 299-307. (2005)

Resumen

La información sobre genes críticos y relevantes para los procesos se puede utilizar para mejorar el control de los bioprocesos. Hasta ahora, los genes marcadores relevantes para los bioprocesos se pueden analizar a través de métodos de análisis de expresión establecidos solamente fuera de línea. Este estudio sugiere un método alternativo para un posible control en línea de la expresión de genes durante los bioprocesos. Este método se basa en la medición de mARN específicos en un chip de ADN eléctrico en conexión con una hibridación tipo sándwich basada en perlas magnéticas. Con el fin de posibilitar una medición en línea de mARN específicos, se desarrolló un método mejorado para el aislamiento rápido y automatizado parcialmente de muestras de ARN de alta calidad. El análisis de expresión del chip de ADN eléctrico se comparó con los micromatrices de ADN ópticos y el RT-PCR en tiempo real para tres genes seleccionados de Bacillus subtilis relevantes para los procesos. Demostramos que el análisis de mARN por medio del chip de ADN eléctrico ofrece resultados similares en comparación con el análisis de micromatrices y la técnica RT-PCR en tiempo real. © 2005 Wiley Periodicals, Inc.

 

Ignatjev, I., Valincius, G., Švedaite, I., Gaidamauskas, E., Kažemekaite, M., Razumas, V., Svendsen, A.
“Direct amperometric determination of lipase activity”
(Determinación amperométrica directa de la actividad de las lipasas). Analytical Biochemistry, 344 (2), págs. 275-277. (2005)

Valincius, G., Ignatjev, I., Niaura, G., Kažemékaité, M., Talaikyté, Z., Razumas, V., Svendsen, A.
“Direct amperometric determination of lipase activity”
(Método electroquímico para la detección de la actividad de las lipasas). Analytical Chemistry, 77 (8), págs. 2632-2636. (2005)

Resumen

Se describe una técnica electroquímica novedosa para la valoración general de la actividad de las lipasas. El método utiliza un sustrato de lipasas con soporte de sólidos formado a través del goteo y secado de una pequeña cantidad de una solución de etanol de 9-(5′-ferrocenilo-pentanoilo-oxi)disulfuro nonilo (FPONDS) en oro modificada por una monocapa autoensamblada de hexilmercaptano. El grupo de ferrocenos con reducción-oxidación de FPONDS genera una señal electroquímica cuya intensidad es proporcional a la cantidad de moléculas de FPONDS en la superficie. Los datos de la espectroscopia de absorción infrarroja electroquímica y con superficie mejorada, así como los experimentos de control con una enzima mutante diseñada y desactivada, demuestran que la lipasa natural de Thermomyces lanuginosus es capaz de romper los enlaces tipo éster de las moléculas de FPONDS mediante un mecanismo de hidrólisis enzimática que incluye la adsorción de la lipasa en la superficie del sustrato. La hidrólisis libera los grupos de ferrocenos de la interfaz y desencadena el deterioro de la señal de reducción-oxidación electroquímica. La tasa de disminución de la señal electroquímica es proporcional a la actividad/concentración de las lipasas. Los datos sugieren un método general para medir de forma directa la actividad enzimática de las lipasas. © 2005 American Chemical Society.

 

Mortensen, P.P., Esbensen, K.H.
“Optimization of the Angle Measure Technique for image analytical sampling of particulate matter”
(Optimización de la técnica de medida de ángulos para el muestreo analítico por imagen de partículas sólidas). Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 75 (2), págs. 219-229. (2005)

Resumen

Se ha realizado la optimización de una aplicación industrial analítica por imagen que utiliza la técnica de medida de ángulos (Angle Measure Technique, AMT) como una parte integrada del cálculo del nivel de polvo en el parámetro de calidad para los gránulos de enzimas encapsuladas. Los principales resultados de AMT de este estudio se puede generalizar a todos los tipos similares de secreción de partículas sólidas. La primera parte de este estudio aborda las estrategias de muestreo por píxeles dentro de una imagen antes de la aplicación de la técnica de medida de ángulos, en la cual la imagen desplegada se considera como un objeto unidimensional. Se halló que los parámetros óptimos para el algoritmo de AMT son muestreos sistemáticos o estratificados de más de 500 puntos de inicio, desplegados de una novedosa forma en espiral o serpenteante desde la imagen fluorescente; este nuevo procedimiento de despliegue elimina ciertos artefactos algorítmicos de "empaquetamiento" que no han necesitado modificaciones hasta ahora. La segunda parte pretende delinear el muestreo analítico por imagen óptica de una serie de imágenes, es decir, la optimización del muestreo de proceso por imagen. La cantidad mínima de imágenes necesarias para obtener un cálculo en línea lo suficientemente adecuado del parámetro QC en cuestión se corresponde con una tasa de muestreo relativamente alta del 15-20 %, en relación con un nivel de error de medición intrínseco de un método de referencia analítico dispuesto. El aumento en la cantidad de incrementos de imagen incluidos en la muestra analítica de imágenes afecta principalmente la exactitud de los cálculos, en tanto la precisión se ve mucho menos afectada, lo que demuestra una estabilidad satisfactoria del método analítico por imagen desarrollado, el cual se encuentra actualmente en implementación industrial. © 2004 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Stocks, S.M.
“Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight”
(Mecanismo y uso de una tinción disponible a nivel comercial que permite determinar la viabilidad: BacLight). Cytometry Part A, 61 (2), págs. 189-195. (2004)

Resumen

Antecedentes: BacLight (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE. UU.) es una conocida tinción de dos componentes basada en fluorescencia que se utiliza para determinar la viabilidad de células bacterianas. El propósito principal de este trabajo era explicar completamente el mecanismo y determinar el motivo por el cual a veces se informa que las células se tiñen simultáneamente vivas y muertas. Métodos: Las soluciones de ADN se tiñeron con los dos componentes: yoduro de propidio (propidium iodide, PI) y SYTO9, con diferentes combinaciones, y se recogieron los espectros de fluorescencia. Resultados: KPl y KSYTO9 fueron aproximadamente 3,7 x 105/M y 1,8 x 105/M. Las emisiones de SYTO9 fueron más fuertes y solaparon las de PI. Se observó una transferencia de energía de resonancia fluorescente de SYTO9 al PI. Fue posible, incluso en condiciones normales, que SYTO9 unido al ADN tuviera un componente en la región roja igual al de PI unido al ADN. También se hallaron emisiones potencialmente confusas cuando el PI no fue lo suficientemente excesivo como para saturar el ácido nucleico (>0,4 M de PI para 1 M de pares de bases de ADN). Conclusiones: El mecanismo es una combinación de desplazamiento de SYTO9 a través de PI, y la extinción de las emisiones de SYTO9 a través de la transferencia de energía de resonancia fluorescente. Los resultados confusos pueden aparecer si no se contabilizan adecuadamente las intensidades relativas de las tinciones o la concentración de PI relativa al ácido nucleico. © 2004 Wiley-Liss, Inc.

 

Hansen, E., Mollerup, J.M.
“The influence of retention on the plate height in ion-exchange chromatography”
(La influencia de la retención en la altura de la placa en la cromatografía de intercambio iónico). Separation Science and Technology, 39 (9), págs. 2011-2030. (2004)

Resumen

Se determinaron las alturas de las placas para el aminoácido tirosina (intercambio aniónico) y el polipéptido aprotinina (intercambio catónico) en un medio poroso (Recurso 15) y un medio filtrado con gel (HyperD 20) con concentraciones de sal cuyo rango de retención osciló de débil a fuerte. A una velocidad constante, las mediciones mostraron que la altura de la placa aumentó con una mayor retención, alcanzó un máximo y, finalmente, disminuyó a medida que la retención aumentó, es decir, cuando la concentración de sal se disminuyó aún más. La dispersión axial y la transferencia de masa causaron el ensanchamiento de banda en un pico cromatográfico de la columna. En este artículo, la velocidad de transferencia de masa en las partículas se describe a través de tres mecanismos de velocidad diferentes, la difusión de poros, la difusión de sólidos y la difusión paralela. Se utilizó la ecuación de van Deemter para modelar los datos y determinar las propiedades de la transferencia de masa. El desarrollo de la altura de la placa con una mayor retención reveló un comportamiento característico para cada mecanismo de velocidad. En el modelo de difusión de poros, la altura de la placa aumentó según un valor constante con una retención fuerte, en tanto la altura de la placa en el modelo de difusión de sólidos disminuyó a medida que se acercaba a un valor constante con una retención fuerte. En el modelo de difusión paralela, ocurrió tanto una difusión de poros como una difusión de sólidos. Por lo tanto, el modelo de difusión paralela coincide con el modelo de difusión de poros con una retención débil y con el modelo de difusión de sólidos con una retención fuerte, en tanto se alcanzó un máximo con una retención intermedia, lo que generó una curva campaniforme. Este comportamiento se corresponde con la variación observada en la altura de la placa a una velocidad constante. Ni el modelo de difusión de poros ni el de difusión de sólidos pueden describir los datos experimentales, mientras que el ajuste satisfactorio se obtuvo utilizando el modelo de difusión paralela.

 

Klenø, T.G., Andreasen, C.M., Kjeldal, H.Ø., Leonardsen, L.R., Krogh, T.N., Neilsen, P.F., Sørensen, M.V., Jensen, O.N.
“MALDI MS peptide mapping performance by in-gel digestion on a probe with prestructured sample supports”
(Resultados de la cartografía peptídica a través de la espectrometría de masas (MS) con ionización por desorción láser asistida por una matriz (MALDI) mediante digestión en gel en una sonda con soportes de muestras preestructurados). Analytical Chemistry, 76 (13), págs. 3576-3583. (2004)

Resumen

La espectrometría de masas (mass spectrometry, MS) con ionización por desorción láser asistida por una matriz (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) se utiliza ampliamente en la química de proteínas y la investigación proteómica para identificar y caracterizar las proteínas aisladas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. En un esfuerzo por minimizar la manipulación de las muestras y aumentar el rendimiento de las muestras, hemos desarrollado un novedoso protocolo de digestión en gel a través del cual la preparación de la muestra se realiza directamente en una sonda de MALDI con soporte de muestras preestructurado. El protocolo cuenta con pocos pasos de manipulación de la muestra y posee un consumo mínimo de reactivos, lo que hace que el protocolo sea sensible y rentable, y permite ahorrar tiempo. Los resultados del protocolo de preparación de la muestra en la sonda se demostraron mediante el análisis de un conjunto de proteínas hepáticas de ratas obtenidas a partir de un gel de poliacrilamida bidimensional con tinción fluorescente (Cy3 y SyproRuby). La tasa de efectividad de la identificación de proteínas mediante la digestión tríptica en la sonda y la cartografía de masa peptídica a través de MALDI fue 89 %. El procedimiento de digestión en gel en la sonda ofreció mayor sensibilidad y mejores resultados en la cartografía de masa peptídica, en comparación con nuestro protocolo estándar de digestión en gel. La técnica de digestión en la sonda hizo que la cobertura de la secuencia de aminoácidos de las proteínas fuera significativamente mejor, principalmente debido a la recuperación y detección eficientes de grandes péptidos hidrofóbicos (<1,5 kDa). Estas observaciones indican que se pierden numerosos péptidos trípticos cuando se utilizan los métodos estándar de digestión en gel y las técnicas de preparación de muestras para MALDI MS. Este estudio también demuestra que el protocolo de digestión en la sonda combinado con la espectrometría de masas en tándem con MALDI proporciona una plataforma robusta para la investigación proteómica, incluso la identificación y determinación proteicas de modificaciones postraduccionales.

 

Grotkjær, T., Åkesson, M., Christensen, B., Gombert, A.K., Nielsen, J.
“Impact of Transamination Reactions and Protein Turnover on Labeling Dynamics in 13C-Labeling Experiments”
(El impacto de las reacciones de transaminación y el recambio proteínico en la dinámica de marcado en experimentos de marcado con C13). Biotechnology and Bioengineering, 86 (2), págs. 209-216. (2004)

Resumen

Se utiliza un modelo dinámico que describe las transiciones de los átomos de carbono en el metabolismo central de Saccharomyces cerevisiae para investigar la influencia de las reacciones de transaminación y el recambio proteínico en el comportamiento transitorio de los experimentos quimiostáticos de marcado con C13. Las simulaciones realizadas sugieren que el intercambio de carbono debido a la transaminación y el recambio proteínico puede aumentar significativamente el tiempo requerido para que los metabolitos en el ciclo de ácido tricarboxílico (tricarboxylic acid, TCA) alcancen un estado isotópico estable, lo cual coincide con las observaciones experimentales publicadas. Por otra parte, la transaminación y el recambio proteínico acelerarán la tasa neta de incorporación del carbono marcado en algunos aminoácidos libres y unidos a las proteínas. Los resultados de la simulación indican que el patrón de la incorporación de carbono marcado en los aminoácidos obtenidos del hidrolizado de biomasa muestra una desviación significativa del comportamiento cinético de primer orden que se asume comúnmente hasta después de tres tiempos de permanencia. Estas observaciones sugieren que se debe tener mayor precaución y, al mismo tiempo, apuntan a nuevas oportunidades en el diseño y la interpretación de los experimentos de marcado con C13. © 2004 Wiley Periodicals, Inc.

 

Navrátil, M., Cimander, C., Mandenius, C.-F.
“On-line Multisensor Monitoring of Yogurt and Filmjölk Fermentations on Production Scale”
(Monitoreo con múltiples sensores en línea de fermentaciones de yogur y filmjölk a escala industrial). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (3), págs. 415-420. (2004)

Resumen

Se utilizaron los datos de la espectrometría en el infrarrojo cercano (near-infrared, NIR) y la nariz electrónica (electronic nose, EN) para el monitoreo en línea de fermentaciones de yogur y filmjölk (una leche agria sueca parecida al yogur) en condiciones industriales. Las señales de NIR y EN se seleccionaron mediante la evaluación de los vectores de carga del análisis de componentes principales y se analizaron luego estudiando la variabilidad de los componentes principales seleccionados. Los primeros componentes principales para las señales de NIR y EN se utilizaron para la generación en línea de un gráfico de la trayectoria del proceso que permitió visualizar el estado real de la fermentación. Las señales de NIR también se utilizaron para configurar los modelos empíricos de mínimos cuadrados parciales (partial least-squares, PLS) para predecir el pH de los cultivos y la acidez titulable (expresada como grados Thorner, oT). Utilizando cinco o seis factores de PLS, los modelos dieron como resultado predicciones aceptables que se podrían mejorar aún más aumentando la cantidad de datos de calibración confiables y precisos. Los resultados presentados demuestran que la fusión de las señales de NIR y EN ofrece la posibilidad de un rápido monitoreo en línea, y permite evaluar la calidad del proceso de fermentación de yogur.

 

Gabig-Ciminska, M., Holmgren, A., Andresen, H., Bundvig Barken, K., Wümpelmann, M., Albers, J., Hintsche, R., Breitenstein, A., Neubauer, P., Los, M., Czyz, A., Wegrzyn, G., Silfversparre, G., Jürgen, B., Schweder, T., Enfors, S.-O.
“Electric chips for rapid detection and quantification of nucleic acids”
(Chips eléctricos para la rápida detección y cuantificación de ácidos nucleicos). Biosensors and Bioelectronics, 19 (6), págs. 537-546. (2004)

Resumen

Se presenta un detector eléctrico con chip de silicona acoplado a una hibridación tipo sándwich basada en perlas (bead-based sandwich hybridization, BBSH) como un método para realizar un análisis rápido de ácidos nucleicos específicos. Para los pasos de bioreconocimiento, se utiliza una plataforma microfluida que incorpora perlas paramagnéticas con sondas de captura inmovilizada. El protocolo implica la hibridación tipo sándwich simultánea de un ácido nucleico monocatenario diana con la sonda de captura en las perlas, y con una sonda de detección en la solución de reacción, seguido del marcado enzimático de la sonda de detección, la reacción enzimática y, finalmente, la medición potenciométrica del producto enzimático en la superficie del chip. Se utilizó un conjugado de fosfatasa alcalina anti-digoxigenina (Anti-DIG) para el marcado enzimático de la sonda de detección marcada con DIG. Se utilizó fosfato p-aminofenol (pAPP) como sustrato. El producto enzimático de la reacción, p-aminofenol (pAP), se oxida en el ánodo del chip para quinonaimina que se reduce a pAP en el cátodo. La oxidación cíclica y la reducción de estos compuestos provocan una corriente que produce una señal característica que se puede relacionar con la concentración del analito. Los resultados de los diferentes pasos del ensayo se caracterizaron utilizando oligonucleótidos de ARN sintetizados in vitro, y luego el instrumento se utilizó para el análisis del ARN ribosomal 16S en un extracto de Escherichia coli. El tiempo de ensayo depende de la sensibilidad requerida. Se evaluaron el ARN diana artificial y el ARN ribosomal 16S en cantidades que oscilaron entre 1011 y 1010 moléculas en 25 min y 4 h, respectivamente. © 2003 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Barken, K.B., Gabig-Ciminska, M., Holmgren, A., Molin, S.
“Effect of unlabeled helper probes on detection of an RNA target by bead-based sandwich hybridization”
(El efecto de las sondas auxiliares no marcadas en la detección de ARN diana mediante hibridación tipo sándwich basada en perlas). BioTechniques, 36 (1), págs. 124-132. (2004)

Resumen

Se evaluaron los oligonucleótidos auxiliares no marcados que asistían en un ensayo de hibridación tipo sándwich basada en perlas para determinar la colocación óptima de las sondas de captura y detección. La diana utilizada era una molécula de mARN completa sintetizada in vitro. Se halló que las sondas auxiliares complementarias a las regiones adyacentes al punto de unión de la sonda de captura conectada del extremo 5′ eran mucho más efectivas que las sondas auxiliares que apuntaban a posiciones adyacentes al punto de unión de la sonda de detección. Se cree que la diferencia se debe a la ruptura de la estructura secundaria del ARN en el área donde se une la sonda de captura y, por lo tanto, se reduce la interferencia estructural de la perla. El uso de auxiliares adicionales mostró un efecto aditivo. El uso de auxiliares en ambos lados de las sondas de captura y detección mostró un aumento de 15 a 40 veces en la eficiencia de hibridación, dependiendo de la diana, y, por lo tanto, aumentó la sensibilidad de los ensayos de hibridación. Al utilizar un chip eléctrico conectado con la sonda de detección para la detección de p-aminofenol, el cual se produce mediante la fosfatasa alcalina, se alcanzó un límite de detección de 2 × 10-13 M de moléculas de ARNm sin el uso de un paso de amplificación del ácido nucleico.