Eijsink, V.G.H., GÅseidnes, S., Borchert, T.V., Van Den Burg, B.
“Directed evolution of enzyme stability”
(La evolución dirigida de la estabilidad enzimática). Biomolecular Engineering, 22 (1-3), págs. 21-30. (2005) 

Resumen

El desarrollo moderno de las enzimas se apoya cada vez más en las estrategias basadas en la generación de diversidad y la posterior detección de variantes con propiedades optimizadas. En principio, estas estrategias de evolución dirigida se pueden utilizar para optimizar cualquier propiedad enzimática, la cual se puede detectar de una forma económicamente viable, incluso si se desconoce la base molecular de la propiedad. La estabilidad es una propiedad interesante de las enzimas porque, en primer lugar, es muy importante a nivel industrial y, en segundo lugar, es relativamente fácil de detectar. Además, la base molecular de la estabilidad posee una estrecha relación con los problemas actuales de la ciencia de las proteínas, como el problema del plegamiento de las proteínas y las enfermedades que derivan de él. Por lo tanto, lograr estabilidad en las enzimas resulta de interés tanto para el ámbito comercial como para el campo científico. En este documento, revisamos cómo la evolución dirigida ha contribuido al desarrollo de enzimas estables y a una nueva visión con respecto a los principios de estabilidad de las proteínas. Se describen numerosos ejemplos recientes. Estos ejemplos muestran que la evolución dirigida es una estrategia efectiva para obtener enzimas estables, particularmente cuando se utiliza en conjunto con estrategias de ingeniería racionales o cuasi racionales. Con respecto a los principios de estabilidad de las proteínas, algunas lecciones importantes para aprender de los esfuerzos recientes en la evolución dirigida son, primero, que hay muchas formas estructurales de estabilizar una proteína, pero no siempre son fáciles de racionalizar; en segundo lugar, que las proteínas se pueden estabilizar optimizando sus superficies; en tercer lugar, que la alta estabilidad térmica se puede obtener sin perder el rendimiento catalítico a bajas temperaturas. © 2005 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

J.R Cherry; A.L. Fidantsef.
“Directed evolution of industrial enzymes: An update”
(La evolución dirigida de las enzimas industriales: una actualización). Curr Opin Biotechnol., 14(4), 438-43 (2003)

Resumen

Usar enzimas en los procesos industriales a menudo puede eliminar el uso de temperaturas altas, solventes orgánicos y valores extremos de pH y, al mismo tiempo, ofrece una mayor especificidad de reacción, pureza del producto y menor impacto en el medioambiente. El uso creciente de enzimas industriales depende de la innovación constante para mejorar el rendimiento y reducir los costos. Esta innovación está impulsada por una base de datos de rápido crecimiento que contiene una diversidad de enzimas naturales, ADN recombinante y tecnologías de fermentación que permiten que esta diversidad se produzca con costos bajos, además de herramientas de modificación de proteínas que permiten ajustar las enzimas para que se adapten al mercado industrial.

 

J.E. Ness; S. Kim; A. Gottman; R. Pak; A. Krebber; T.V. Borchert; S. Govindarajan; E.C. Miundorff; J. Minshull.
“Synthetic shuffling expands functional protein diversity by allowing amino acids to recombine independently”
(La mezcla aleatoria sintética expande la diversidad de las proteínas funcionales permitiendo que los aminoácidos se recombinen de manera independiente). Nature Biotechnology, 20, 1251-1255 (2002)

Resumen

Describimos la mezcla aleatoria sintética, una tecnología evolutiva de ingeniería de proteínas en la cual cada aminoácido de un conjunto de precursores puede recombinarse independientemente de los otros aminoácidos. A partir del uso de oligonucleótidos degenerados, la mezcla aleatoria sintética abre una ruta directa desde la información de secuencias de la base de datos a las bibliotecas funcionales. Los genes de iniciación física son innecesarios, y también se pueden incorporar criterios de diseño adicionales, como el uso óptimo de codones o mutaciones beneficiosas conocidas. Realizamos una mezcla aleatoria sintética de 15 genes de subtilisina y obtuvimos enzimas activas y altamente quiméricas con combinaciones deseables de propiedades que no obtuvimos mediante otros métodos de evolución dirigida.

 

S. Danielsen; M. Eklund: H-J. Deussen; T. GrSslund; P-Å. Nygren;T. V. Borchert.
“In vitro selection of enzymatically active lipase variants from phage libraries using a mechanism-based inhibitor”
(Selección in vitro de variantes de lipasa enzimáticamente activa de bibliotecas de bacteriófagos utilizando un inhibidor basado en el mecanismo).
Gene, 272, 267-274 (2001)

Resumen
La “lipasa del detergente”, Lipolase ®, de Thermomyces lanuginosa se sometió a una técnica de ingeniería combinatoria de proteínas/“Phage Display” con el objetivo de identificar nuevas variantes de la enzima con mejores características en presencia de detergentes. Primero, se demostró que se podía producir Lipolase ® natural en Escherichia coli reteniendo toda la actividad y que se podía expresar como una enzima activa fusionada con la proteína de cubierta 3 en el bacteriófago M13 de E. coli. Luego, se construyó una biblioteca de fagémidos diseñada para generar aproximadamente de dos a tres mutaciones por gen de lipasa. Se aleatorizaron nueve aminoácidos en dos regiones cercanas al sitio activo. Las selecciones a través de un inhibidor biotinilado basado en el mecanismo mostraron que los bacteriófagos que expresaron Lipolase ® se podían enriquecer específicamente a partir de una población de bacteriófagos de control. Las selecciones de un stock de bacteriófagos de la biblioteca en presencia del inhibidor y un detergente en polvo comercial provocaron un aumento por etapas en la proporción de clones activos. El análisis de 84 clones activos reveló que todos expresaron actividad de la lipasa, pero con menor actividad que la del clon productor de Lipolase ® natural. En seis de los siete clones más activos, una serina natural en la posición 83 había sido reemplazada por treonina, una sustitución que se sabe que altera la preferencia de longitud de la cadena de sustratos de las variantes de Lipolase ®. Asimismo, la selección había enriquecido las variantes de las enzimas con un alto grado de carácter conservativo en una de las regiones abigarradas, lo que sugiere que esta región es importante para la actividad enzimática y que el procedimiento de selección diseñado fue relevante. Las variantes seleccionadas contenían principalmente residuos de aminoácidos dentro de otra región abigarrada. En conjunto, los resultados descritos muestran que se pueden diseñar protocolos de selección basados en la actividad enzimática para esta clase de enzima que debería ser de importancia para futuros intentos de ingeniería de proteínas.