Bonnin, E., Clavurier, K., Daniel, S., Kauppinen, S., Mikkelsen, J.D.M., Thibault, J.-F.
“Pectin acetylesterases from Aspergillus are able to deacetylate homogalacturonan as well as rhamnogalacturonan”
(Las acetilesterasas pécticas de Aspergillus son capaces de desacetilar el homogalacturonano y también el ramnogalacturonano). Carbohydrate Polymers. Artículo en prensa. (2008)

Resumen
Se purificó una acetilesterasa de Aspergillus aculeatus según su habilidad para desacetilar el homogalacturonano. Se preparó una serie de sustratos bien caracterizados que se utilizaron para investigar su especificidad, incluyendo la pectina con diversos grados de metilación y acetilación, los dominios pécticos con diversas estructuras y los oligómeros. Luego, se comparó con una acetilesterasa de ramnogalacturonano previamente aislada del mismo hongo. Ambas enzimas estuvieron activas con diversas pectinas acetiladas, y fueron capaces de liberar grupos acetilo del homogalacturonano, oligogalacturonato y ramnogalacturonano acetilados en diferentes grados. Por lo tanto, se concluyó que en tanto las dos enzimas diferían en su eficiencia, ambas son acetilesterasas pécticas y son capaces de actuar en las regiones “lisas” y las regiones “densas” de la pectina. © 2008 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

 

Wang, B., Wu, W., Liu, X.
“Purification and characterization of a neutral serine protease with nematicidal activity from Hirsutella rhossiliensis”
(Purificación y caracterización de una proteasa de serina neutral con actividad nematicida de Hirsutella rhossiliensis). Mycopathologia, 163 (3), pp. 169-176. (2007)

Resumen
La proteasa de serina desempeña un papel importante en la infección fúngica de huéspedes invertebrados. Se detectó una proteasa extracelular (Hnsp) en un cultivo líquido de Hirsutella rhossiliensis OWVT-1 con nematodos (Panagrellus redivivus) como la única fuente de nitrógeno y se purificó hasta homogeneizar con una precipitación de sulfato de amonio, una cromatografía de intercambio aniónico y filtración por gel. Su masa molecular era aproximadamente 32 kDa, y el valor de pH de reacción óptimo y la temperatura eran pH 7 y 40 °C, respectivamente. La actividad de Hnsp fue estable con un pH de 6-8, y disminuyó radicalmente a 50 °C durante 10 minutos. Hnsp fue muy sensible al inhibidor de PMSF y descompuso adecuadamente el sustrato N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe- p-nitroanilida, lo que sugiere que pertenecía a la quimotripsina/subtilisina de las proteasas de serina. La secuencia de aminoácidos del extremo aminoterminal de Hnsp fue SVTDQQGADCGLARISHRE, lo que demostró una alta homología con otras proteasas de serina del hongo nematófago. La capacidad para matar el nematodo y degradar su cutícula in vitro indicó que Hnsp podría participar en la infección del nematodo. © 2007 Springer.

 

Langston, J., Blinkovsky, A., Byun, T., Terribilini, M., Ransbarger, D., Xu, F.
“Substrate specificity of Streptomyces transglutaminases" Applied Biochemistry and Biotechnology”
(Especificidad del sustrato de Streptomyces transglutaminases). Applied Biochemistry and Biotechnology, 136 (3), pp. 291-308. (2007)

Resumen
La transglutaminasa (TGase) es una enzima multifuncional fundamental para muchos procesos fisiológicos, como la diferenciación celular, la regeneración de tejidos y la patogenia de plantas. La función de transferencia de los grupos acilo de la enzima puede activar grupos amino primarios y, en consecuencia, acoplarlos en una glutamina peptidil, una reacción importante para diversas conjugaciones proteicas in vivo e in vitro, y otros procesos de modificación. A fin de comprender mejor la relación entre la estructura y la función de la enzima, y para desarrollarla mejor como un catalizador biológico industrial, estudiamos TGase secretada por numerosas especies de Streptomyces y Phytophthora cactorum. Purificamos la enzima de S. lydicus, S. platensis, S. nigrescens, S. cinnamoneus y S. hachijoensis. Se determinaron los perfiles de pH y temperatura de las TGase de S. lydicus, S. platensis y S. nigrescens. Se caracterizó la especificidad de la TGase de S. lydicus en función de sus sustratos aminos que aceptaban los grupos acilo. La correlación de las características electrónicas y estéricas de los sustratos con su reactividad respaldó el mecanismo que se propuso anteriormente para la TGase de Streptomyces mobaraensis. Copyright © 2007 de Humana Press Inc. Reservados todos los derechos de cualquier tipo.

 

Sørensen, H.R., Jørgensen, C.T., Hansen, C.H., Jørgensen, C.I., Pedersen, S., Meyer, A.S.
“A novel GH43 α-L-arabinofuranosidase from Humicola insolens: Mode of action and synergy with GH51 α-L-arabinofuranosidases on wheat arabinoxylan”
(Una GH43 α-L-arabinofuranosidasa novedosa de Humicola insolens: modo de acción y sinergia con GH51 α-L-arabinofuranosidasas en el arabinoxilano del trigo). Applied Microbiology and Biotechnology, 73 (4), pp. 850-861. (2006)

Resumen
Se clonó una α-l-arabinofuranosidasa (α-AraF) novedosa perteneciente a la familia 43 de glucosidasas (GH) a partir de Humicola insolens y se expresó en Aspergillus oryzae. El análisis del espectro de resonancia magnética nuclear de 1H (1H-RMN) reveló que la enzima GH43 novedosa hidrolizó selectivamente los residuos de (1→3)-α-l-arabinofuranosilo de los residuos de xilopiranosilo de sustitución doble en el arabinoxilano y en los oligosacáridos derivados del arabinoxilano. La actividad óptima de la enzima clonada fue con un pH de 6,7 y 53 °C. Se clonaron otras dos α-l-arabinofuranosidasas (α-AraFs) novedosas, ambas pertenecientes a la familia 51 de GH, a partir de H. insolens y de Meripilus giganteus de basidiomiceto con pudrición blanca. Ambas enzimas GH51 catalizaron la eliminación de los residuos de (1→2) y (1→3)-α-l-arabinofuranosilo desde xilopiranosilos de sustitución simple en arabinoxilano; los resultados de arabinosa más altos se obtuvieron con la enzima de M. giganteus. Las combinaciones (50:50) de GH43 α-AraF de H. insolens y GH51 α-AraFs de M. giganteus o H. insolens dieron como resultado un aumento sinérgico en la liberación de arabinosa a partir de arabinoxilano de trigo soluble en agua en reacciones extendidas con pH de 6 y 40 °C. Esta interacción sinérgica entre GH43 y GH51 α-AraFs también fue evidente cuando una GH43 α-AraF de Bifidobacterium sp. se complementó en combinación con cualquiera de las enzimas de GH51. Se cree que el efecto sinérgico se debe a que GH51 α-AraFs es capaz de catalizar la eliminación de (1→2)-α-l- arabinofuranosilos de asentamiento único que resultaron después de que la enzima GH43 había catalizado la eliminación de los residuos de (1→3)-α-l-arabinofuranosilo en xilopiranosilos de sustitución doble en el arabinoxilano de trigo. © 2006 Springer-Verlag.

 

Rasmussen, L.E., Sørensen, H.R., Vind, J., Viksø-Nielsen, A.
“Mode of action and properties of the β-xylosidases from Talaromyces emersonii and Trichoderma reesei”
(Modo de acción y propiedades de las β-xilosidasas de Talaromyces emersonii y Trichoderma reesei). Biotechnology and Bioengineering, 94 (5), pp. 869-876. (2006)

Resumen
La hidrólisis enzimática del arabinoxilano es un requisito previo importante para la utilización de la hemicelulosa en la fermentación con etanol o para fabricar xilitol como edulcorante de bajas calorías a través de la hidrogenación catalítica de la xilosa generada. Este estudio se centra en la clonación y caracterización de dos β-xilosidasas industriales relevantes (1,4-β-D-xilano xilohidrolasa, EC 3.2.1.37) a partir de Talaromyces emersonii (βXTE) y Trichoderma reesei (βXTR), y en una comparación de estos en relación con la hidrólisis de hemicelulosa utilizando un sustrato industrial relevante. Ambas β-xilosidasas se expresaron en A. oryzae y se purificaron posteriormente. Durante la hidrólisis enzimática de la xilobiosa, se halló que el producto de la reacción de ambas enzimas era β-D-xilosa, lo que demuestra que la hidrólisis procede a través de un mecanismo de reacción de retención. Con base en las similitudes de la secuencia y la pertenencia a la familia de las glucosidasas, se prevé que los residuos de sitios activos de βXTE y βXTR son Asp 242 y Glu 441, y Asp 264 y Glu 464, respectivamente. Se evaluó esta participación en la catálisis de estos carboxilos a través de una modificación y utilizando el procedimiento de carbodiimidas y nucleófilos que generó una inactivación completa de ambas enzimas. El grado de liberación de xilosa de la vinaza, un subproducto de la fermentación con etanol, a través de βXTE y βXTR fue 12,1 % y 7,7 %, respectivamente. Al utilizar las β-xilosidasas en combinación con el producto enzimático de múltiples componentes Ultraflo L se generó una liberación de xilosa del 41,9 % y 40,8 %, respectivamente, lo que indica un fuerte efecto sinérgico entre las β-xilosidasas de actuación exógena y las endo-1,4-β- xilanasas y α-L-arabinofuranosidasa en Ultraflo L. Parece que no existen diferencias mensurables entre las dos β-xilosidasas cuando se las utiliza en esta aplicación específica a pesar de las diferencias en la actividad específica y las propiedades cinéticas. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.

 

Thiemann, V., Saake, B., Vollstedt, A., Schäfer, T., Puls, J., Bertoldo, C., Freudl, R., Antranikian, G.
“Heterologous expression and characterization of a novel branching enzyme from the thermoalkaliphilic anaerobic bacterium Anaerobranca gottschalkii”
(Expresión heteróloga y caracterización de una enzima ramificadora novedosa de la bacteria anaerobia termo-alcalófila Anaerobranca gottschalkii). Applied Microbiology and Biotechnology, 72 (1), pp. 60-71. (2006)

Resumen
El gen que codifica la enzima ramificadora (branching enzyme, BE) de la bacteria anaerobia termo-alcalófila Anaerobranca gottschalkii se fusionó con una secuencia señal dependiente de la vía secretora de translocación y exportación de proteínas plegadas (twin arginine translocation) de Escherichia coli y expresada en Staphylococcus carnosus. La BE secretada se purificó utilizando una interacción hidrofóbica y cromatografía de filtración en gel. La enzima monomérica (72 kDa) muestra actividad máxima a 50° C y con un pH de 7,0. Con la amilosa, la BE muestra una alta transglucación y una actividad hidrolítica extremadamente baja. Se analizó la conversión de amilosa y dextrinas lineales aplicando una cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento y cromatografía cuantitativa de exclusión por tamaño molecular. Se convirtió la amilosa (104-4×107 g/mol) a un grado mayor a productos que muestran masas moleculares de 10 4-4×105 g/mol, lo que indica que la enzima se podría aplicar a la producción de almidón o dextrinas con distribuciones de masa molecular estrechas. La mayoría de los oligosacáridos transferidos, determinados tras la hidrólisis enzimática de las uniones de α-1,6 recientemente sintetizadas, oscilaron entre 103 y 104 g/mol, lo que corresponde a un grado de polimerización (DP) de 6-60. La longitud de la cadena de donante mínima es DP 16. Asimismo, los resultados obtenidos respaldan la hipótesis de un mecanismo aleatorio de endo-ruptura de BE y la aparición de ramificaciones entre la cadena. © Springer-Verlag 2006.

 

Langston, J., Sheehy, N., Xu, F.
“Substrate specificity of Aspergillus oryzae family 3 β-glucosidase”
(Especificidad del sustrato de β-glucosidasa de la familia 3 de Aspergillus oryzae). Biochimica et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics, 1764 (5), pp. 972-978. (2006)

Resumen
Entre las glucosidasas, la β-glucosidasa desempeña un papel único en muchos procesos fisiológicos y biocatalíticos que implican la unión de O-glicosil por enlaces β de diversos sacáridos oligoméricos o glucósidos. Desde el punto de vista estructural, la enzima se puede agrupar en la familia 1 y 3 de glucosidasas. Aunque se ha establecido el mecanismo básico (“retención, doble desplazamiento”) para la catálisis de la β-glucosidasa de la familia 3, todavía no se conoce de manera exhaustiva la relación entre la estructura y la función, particularmente la especificidad del sustrato que es de gran interés para desarrollar la enzima como un catalizador biológico versátil. A fin de examinar más profundamente el sitio activo, llevamos a cabo un estudio en una β-glucosidasa de la familia 3 de Aspergillus oryzae con sustratos e inhibidores competitivos de diferentes estructuras, con el fin de evaluar las interacciones espaciales y químicas específicas del sitio entre el sustrato de piranosilo y la enzima. Nuestros resultados demostraron que la enzima tiene un requisito estereoquímico estricto (para alojar la β-d-glucopiranosa) para su subsitio activo "- 1", en contraste con su contraparte de la familia 1. © 2006 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Viksø-Nielsen, A., Andersen, C., Hoff, T., Pedersen, S.
“Development of new α-amylases for raw starch hydrolysis”
(Desarrollo de α-amilasas nuevas para la hidrólisis de almidón crudo). Biocatalysis and Biotransformation, 24 (1-2), pp. 121-127. (2006)

Resumen
Este trabajo describe el descubrimiento de una nueva α-amilasa de 4 dominios de Anoxybacillus contaminans que hidroliza de un modo muy eficiente el granulado de almidón crudo. En comparación con las tradicionales α-amilasas licuantes del almidón, esta nueva α-amilasa de 4 dominios contiene un dominio de unión del almidón. La presencia de este dominio de unión del almidón permite a la enzima hidrolizar de manera eficiente el almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización. A una temperatura de reacción de 60 °C, y en combinación con una glucoamilasa de Aspergillus niger, fue posible licuar el 99 % del almidón y obtener un valor DX de 95 %. Asimismo, describimos cómo el proceso actual de jarabe de maíz de alta fructosa (high fructose corn syrup, HFCS) se puede convertir en un proceso de licuado y sacarificación simultáneo a temperatura baja mediante el uso de esta nueva α-amilasa de 4 dominios en combinación con una glucoamilasa. © 2006 Taylor & Francis.

 

Yang, J., Huang, X., Tian, B., Sun, H., Duan, J., Wu, W., Zhang, K.
“Characterization of an extracellular serine protease gene from the nematophagous fungus Lecanicillium psalliotae”
(Caracterización de un gen de la proteasa de serina extracelular del hongo nematófago Lecanicillium psalliotae). Biotechnology Letters, 27 (17), pp. 1329-1334. (2005)

Resumen
Se clonó el gen que codifica una proteasa de serina degradante de la cutícula de tres cepas de Lecanicillium psalliotae (syn. Verticillium psalliotae) mediante el método de amplificación rápida de los extremos del cDNA (rapid amplification of cDNA ends, RACE) de 3′ y 5′. El gen codifica para 382 aminoácidos y la proteína comparte los motivos observados con la subtilisina N y peptidasa S8. La comparación de secuencias de cDNA traducidas de tres cepas reveló un polimorfismo de aminoácidos en la posición 230. La secuencia de proteasa deducida compartía un alto grado de similitudes con otras proteasas degradantes de la cutícula de otros hongos nematófagos. © Springer 2005.

 

Bermek, H., Yazici, H., Öztürk, H., Tamerler, C., Jung, H., Li, K., Brown, K.M., Ding, H., Xu, F. “Purification and characterization of manganese peroxidase from wood degrading fungus Trichophyton rubrum LSK-27”
(Purificación y caracterización de la peroxidasa de manganeso del hongo degradante de la madera Trichophyton rubrum LSK-27). Enzyme and Microbial Technology, 35 (1), pp. 87-92. (2004)

Resumen
Se purificó una peroxidasa de manganeso (MnP) de un hongo degradante de la madera Trichophyton rubrum LSK-27 hasta homogeneizarla mediante cromatografía de intercambio aniónico seguida de filtración por gel. Se determinó la masa molecular de la enzima purificada en aproximadamente 42 kDa a través de electroforesis en gel de poliacrilamida con laurilsulfato de sodio (SDS-PAGE). El análisis espectrofotométrico de la enzima reveló un máximo de 407 nm en la banda de Soret, y dos picos visibles a 502 y 644 nm, que coinciden con el espectro fotométrico de otros MnPs. El análisis espectrométrico de masa de la proteína digerida reveló que tenía una homología muy alta con una peroxidasa única (un híbrido de MnP y lignina peroxidasa) de Bjerkandera sp. B33/3. La MnP de Bjerkandera fue capaz de oxidar el alcohol veratrílico, en tanto la MnP de T. rubrum LSK-27 no pudo hacerlo. La MnP de T. rubrum LSK-27 tuvo el valor pl más alto de 8,2 entre las MnP informadas hasta el momento. La enzima fue estable a temperaturas relativamente altas y, en comparación con otras MnP, esta MnP fue más estable en presencia de concentraciones elevadas de H2O2. © 2004 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

 

Bertoldo, C., Armbrecht, M., Becker, F., Schäfer, T., Antranikian, G., Liebl, W.
“Cloning, sequencing, and characterization of thermoalkalistable type I pullulanase from Anaerobranca gottschalkii”
(Clonado, secuenciación y caracterización de una pululanasa de tipo I termoestable a los álcalis de Anaerobranca gottschalkii). Applied and Environmental Microbiology, 70 (6), pp. 3407-3416. (2004)

Resumen
Se identificó el gen que codifica una pululanasa de tipo I de la secuencia genómica de la bacteria anaerobia termo-alcalófila Anaerobranca gottschalkii. Asimismo, el gen homólogo se aisló de la biblioteca de genes de Anaerobranca horikoshii y se secuenció. Las proteínas codificadas por estos dos genes mostraron una identidad en la secuencia de aminoácidos del 39 % con respecto a las pululanasas de las bacterias aerobias termófilas Fervidobacterium pennivorans y Thermotoga maritima. El gen de la pululanasa de A. gottschalkii (que codifica 865 aminoácidos con una masa molecular prevista de 98 kDa) se clonó y expresó en la cepa BL21(DE3) de Escherichia coli para que la proteína no tuviera el péptido señal. Por consiguiente, la masa molecular de la pululanasa recombinante purificada (rPulAg) fue de 96 kDa. La actividad de hidrólisis pululana fue óptima con un pH de 8,0 y 70 °C, y en estas condiciones fisicoquímicas, la vida media de rPulAg fue 22 h. Al utilizar una estrategia de expresión alternativa en E. coli Tuner(DE3)(pLysS), se clonó el gen de la pululanasa de A. gottschalkii, incluso su secuencia de codificación del péptido señal. En este caso, la enzima recombinante purificada fue una forma truncada de 70-kDa (rPulAg′). La secuencia ligada al extremo aminoterminal de rPulAg′ purificada se halló en 252 aminoácidos por debajo del sitio de partida, lo que probablemente indica que E. Coli pudo haber efectuado un inicio de traducción alternativo o una ruptura de la proteasa ligada al extremo aminoterminal. Resulta interesante que la mayoría de las propiedades fisicoquímicas de rPulAg′ fueron idénticas a las de rPulAg. Ambas enzimas degradaron el pululano a través de un mecanismo endotípico dando como resultado maltotriosa como producto final, y también se detectó actividad hidrolítica con amilopectina, almidón, β-dextrinas límite y glucógeno, pero no con amilosa. La especificidad de este sustrato es típico de las pululanasas de tipo I. rPulAg fue inhibida por ciclodextrinas, en tanto la adición de cationes monovalentes o bivalentes no tuvo un efecto estimulante. Además, rPulAg′ fue estable en presencia de 0,5 % de laurilsulfato de sodio, 20 % de Tween y 50 % de Tritón X-100. La pululanasa de A. gottschalkii es la primera pululanasa de tipo I termoestable a los álcalis que se ha descrito.

 

M.L. Shinohara; M.Ihara; M.Abo; M.Hashida; S.Takagi; T.C.Beck.
“A novel thermostable branching enzyme from an extremely thermophilic bacterial species, Rhodothermus obamensis”
(Una enzima ramificadora termoestable novedosa de una especie bacteriana extremadamente termófila, la Rhodothermus obamensis). Appl Microbiol Biotechnology, 57, 653-659 (2001)

Resumen

Se aisló el gen de una enzima ramificadora (EC 2.4.1.18) de una bacteria extremadamente termófila: Rhodothermus obamensis. La proteína prevista codifica un polipéptido de 621 aminoácidos con un peso molecular previsto de 72 kDa. La secuencia de aminoácidos deducida comparte entre un 42 % y un 50 % de similitud con secuencias de enzimas ramificadoras bacterianas conocidas. De manera similar a las enzimas ramificadoras de Bacillus, la proteína prevista posee una extensión más corta de aminoácidos del extremo aminoterminal que la de la enzima ramificadora de E. coli.  La secuencia de aminoácidos deducida no parece contener una secuencia señal, lo que sugiere que es una enzima intracelular.  La enzima ramificadora de R. obamensis se expresó de manera satisfactoria tanto en E. coli como en un hongo filamentoso, Aspergillus oryzae.  La enzima mostró una actividad catalítica óptima con un pH de 6,0-6,5 y 65 °C.  La enzima fue estable después de 30 min a 80 °C, y retuvo el 50 % de la actividad a 80 °C tras 16 horas.  La actividad ramificadora de la enzima fue mayor con la amilosa que con la amilopectina.  Esta es la primera enzima ramificadora termoestable asilada de un termófilo extremo.


F. Xu; E.J. Golightly; C.C. Fuglsang; P. Schneider P, K.R. Duke. L. Lam; S. Christensen; K.M. Brown; C.T. Jorgensen; S.H. Bro wn.
“A novel carbohydrate : acceptor oxidoreductase from Microdochium nivale”
(Una novedosa oxidorreductasa aceptora de carbohidratos de Microdochium nivale). Eur. J. Biochem., 268, 1136-1142 (2001)
 
Resumen

Se purificó, clonó, expresó de manera heteróloga y caracterizó una oxidorreductasa aceptora de carbohidratos de Microdochium nivale. El gen que codifica la proteína mostró un intrón, y ORF mostró una secuencia con baja homología (igual o menos que un 25 % de identidad o 65 % de similitud) con otras oxidasas de carbohidratos que contienen flavina. La maduración de la proteína requirió la ruptura de un propéptido tetramérico además de un péptido señal de 18 aminoácidos. Se halló que la enzima tenía una masa molecular relativa de 55 000 Da, un punto isoeléctrico de 9 y un flavín mononucleótido (FAD) por proteína. Pudo oxidar sacáridos monoméricos, oligoméricos y poliméricos y transferir sus electrones a O-2 u otros aceptores. Cuando la D-glucosa sirvió como sustrato donante de electrones, se observó una actividad de 2 s(-1) con un pH de 5,5 y 23 °C. Entre los diversos oligosacáridos, la enzima prefirió las dextrinas tetraméricas, lo que indica una interacción favorable de cuatro unidades de glucosa unidas con el lugar del sustrato. La estructura única y la capacidad de oxidar sacáridos oligoméricos/poliméricos sugieren una perspectiva prometedora de la enzima para diversas aplicaciones industriales/medicinales.
 
 
F. Xu; E.J. Golightly; P. Schneider; R.M. Berka; K.M. Brown; J.A. Johnstone; D.H. Baker; C.C. Fuglsang; S.H. Brown; A.V. Klotz. 
“Expression and characterization of a recombinant Fusarium spp. galactose oxidase”
(Expresión y caracterización de una galactosa-oxidasa de Fusarium spp. recombinante). Appl. Biochem. Biotechnol.  88, 23-32 (2000)

Resumen

La galactosa-oxidasa de Fusarium spp. (Dactylium dendroides) se expresó en huéspedes de Aspergillus oryzae y Fusarium venenatum.  Bajo el control de una α-amilasa de A. niger o un promotor de tripsina de Fusarium, se logró una expresión de la galactosa-oxidasa de alto nivel.  Se purificó y caracterizó la oxidasa recombinante expresada en el huésped de A. oryzae.  La enzima purificada tuvo un peso molecular de 66 kDa en la electroforesis en gel de poliacrilamida con laurilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y 0,4 mol de átomos de cobre por mol de proteína.  La estequiometría aumentó a 1,2 después de la saturación de Cu.  Según el ensayo acoplado con peroxidasa, la preparación de la enzima mostró una actividad de 440 recambios por segundo con respecto a la D-galactosa (0,1 M) con un pH de 7 y 20 °C.  La enzima tuvo una temperatura óptima de 60 °C con un pH de 6,0, y una energía de activación libre de Gibbs de 33 kJ/mol.  Se evaluó una serie de derivados de la D-galactosa como el sustrato reductor para la oxidasa.  La diferencia en la actividad se interpretó mediante la estereoespecificidad de la oxidasa con respecto a los sustituyentes en el sustrato de piranosa, particularmente en los sitios C5 y O de hemiacetales cíclicos.  La oxidasa recombinante pudo actuar en algunos polisacáridos con galactosa, como la goma guar, pero no pudo oxidar muchos compuestos comunes de oxidorreducción que no poseían un grupo funcional de alcohol primario.

 

R.M. Berka; P. Schneider; E.J. Golightly; S.H. Brown; M. Madden, K.M. Brown, T. Halkier, K. Mondorf; F. Xu.
“Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of Myceliophthora thermophila and analysis of the recombinant enzyme produced in Aspergillus oryzae”
(Caracterización del gen que codifica una lacasa extracelular de Myceliophthora thermophila y análisis de la enzima recombinante producida en Aspergillus oryzae). Appl. Environ. Microbiol. 63, 3151-3157 (1997)

Resumen

Se aisló un segmento de ADN genómico que codifica una lacasa extracelular del hongo termófilo Myceliophthora thermophila, y se determinó la secuencia de nucleótidos de este gen. La secuencia de aminoácidos deducida de la lacasa de M. thermophila (MtL) muestra una homología con las lacasas de diversos géneros fúngicos. Para la expresión heteróloga en A. oryzae, se construyó un vector que contiene la región codificante de la lacasa de M. thermophila bajo control transcripcional de un promotor y terminador del gen de alfa-amilasa de Aspergillus oryzae. Se purificó la lacasa recombinante expresada en A. oryzae para lograr homogeneidad electroforética mediante cromatografía de intercambio aniónico. Los datos de la secuencia de la aminoterminal sugieren que MtL se sintetiza como una preproenzima. La masa molecular se calculó en aproximadamente 100-140 kDa a través de filtración por gel en Sephacryl S-300, y en 85 kDa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con laurilsulfato de sodio. El análisis de carbohidratos reveló que MtL contiene entre 40 % y 60 % de glicosilación. La lacasa muestra un espectro de absorbancia que es típico de las oxidasas de cobre azul, con un valor máximo de 276 nm y 589 nm, y contiene 3,9 átomos de cobre por subunidad. Con siringaldazina como sustrato, MtL tuvo una actividad óptima con un pH de 6,5 y retiene casi el 100 % de su actividad cuando se incuba a 60 °C durante 20 minutos. Este es el primer informe del clonado y la expresión heteróloga de una lacasa termoestable.