Jacobsen, J., Lydolph, M., Lange, L.
“Culture independent PCR: An alternative enzymes discovery strategy”
(PCR independiente del cultivo: una estrategia alternativa para el descubrimiento de enzimas). (2005) Journal of Microbiological Methods, 60 (1), págs. 63-71.

Resumen
Los iniciadores degenerativos se diseñaron para su uso en la detección de la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) independiente del cultivo del ADN a partir de comunidades fúngicas compuestas, residuos que habitan en rastrojos y hojas de maíz. De acuerdo con búsquedas y alineaciones de similitudes, se observaron secuencias de clones amplificadas afiliadas con la familia de glucósido hidrolasas 7 y glucósido hidrolasas 45 a través de una divergencia de secuencias considerable. Las glucósido hidrolasas de las familias 7 y 45 desempeñan un papel esencial en la conversión de biomasa en el combustible etanol. La investigación sobre esta fuente de energía renovable tiene dos objetivos: (i) contribuir al desarrollo de una alternativa renovable a las limitadas reservas de petróleo fósil crudo del mundo y (ii) reducir la contaminación atmosférica. La amplificación con iniciadores específicos del ADNr 18S reveló la presencia de especies de los órdenes Sordariales e Hypocreales de ascomicetos, así como del orden Agaricales de basidiomicetos en estas comunidades. Nuestro estudio documenta el valor de la PCR independiente del cultivo en estudios de diversidad microbiana y podría sumar al desarrollo de una nueva tecnología de detección de enzimas. © 2004 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados. 


Becker, F., Schnorr, K., Wilting, R., Tolstrup, N., Bendtsen, J.D., Olsen, P.B.
“Development of in vitro transposon assisted signal sequence trapping and its use in screening Bacillus halodurans C125 and Sulfolobus solfataricus P2 gene libraries”
(Desarrollo de captación de secuencia de señales asistida por transposones in vitro y su uso en la detección de genotecas del Bacillus halodurans C125 y del Sulfolobus solfataricus P2). (2004) Journal of Microbiological Methods, 57 (1), págs. 123-133.

Resumen
Para identificar genes que codifican proteínas extracitosólicas, se construyó un minitransposón, TnSig, que contiene una betalactamasa (′bla) de menos señal como gen informante y se lo usó para la transposición in vitro de genotecas producidas en la Escherichia coli. El gen ′bla se clonó en un minitransposón bacteriófago Mu que permitió fusiones translacionales entre el ′bla y los genes objetivos. La fusión del TnSig en el marco de lectura correcto con una proteína que transportaba dominios transmembrana o péptidos de señales causó la resistencia a la penicilina del clon correspondiente. Se etiquetaron con TnSig las genotecas procarióticas de la bacteria alcalófila Bacillus halodurans C125 y la arqueobacteria hipertermófila Sulfolobus solfataricus P2. Se usaron secuencias genómicas, que se encuentran disponibles al público (EMBL BA000004 y EMBL AE006641), para la identificación rápida de marcos de lectura abiertos (open reading frame, ORF) y la predicción de la ubicación de las proteínas en la célula. Con este método, se identificaron con éxito los genes de las proteínas secretadas, las proteínas transmembrana y las lipoproteínas. En contraste con estrategias anteriores de identificación con transposones, el método que se describe aquí es rápido y versátil, y esencialmente permite el etiquetado de cualquier colección compatible con marcadores seleccionables. Es idóneo para identificar genes que codifican proteínas extracitosólicas en genotecas de una amplia gama de organismos procarióticos. © 2004 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.


W. Helbert; H. Chanzy; T.L. Husum; M. Schülein; S. Ernst.
“Fluorescent cellulose microfibrils as substrate for the detection of cellulase activity”
(Microfibrillas de celulosa fluorescentes como sustrato para la detección de actividad de la celulasa). Biomacromolecules, 4, 481-487 (2003)

Resumen
A fin de idear un ensayo de celulasa sensible basado en sustratos que tienen la mayoría de las características físicas de la celuosa natural, se usó 5-(4,6-diclorotriazinil)aminofluorescente (DTAF) como agente de injerto para preparar suspensiones de microfibrillas fluorescentes obtenidas de celulosa bacteriana. Se digirieron estas suspensiones mediante una serie de celulasas comercialmente relevantes de origen Humicola insolens: Cel6B y Cel45A clonadas, así como complejo de H. insolens crudo. La digestión indujo la liberación de celodextrinas fluorescentes, así como de azúcares reductoras. Tras la centrifugación adecuada, se analizaron estos productos solubles como una función del contenido de injerto, tiempo de digestión y características de la celulasa. Los datos que se obtuvieron permitieron optimizar las condiciones de injerto a fin de maximizar la cantidad de productos solubles y, por lo tanto, aumentar la sensibilidad de la detección. Una comparación entre la cantidad de birrefringencia liberada y la cantidad de azúcar reductora liberada permitió diferenciar entre las exo y endoactividades procesivas de la celulasa.  El moldeado de películas de microfibrillas con injerto de DTAF en la parte inferior de las placas de titulación con micropocillos también condujo a la detección de celulasa sensible. Como estas películas conservaron su integridad y permanecieron pegadas con firmeza al fondo del pocillo durante el tiempo de digestión, están bien hechas a medida para una automatización total de las pruebas de celulasas.


V. Boyer; S. Fort; T.P. Frandsen; M. Schulein; S. Cottaz; H. Driguez.
“Chemoenzymatic synthesis of a bifunctionalized cellohexaoside as a specific substrate for the sensitive assay of cellulase by fluorescence quenching”
(Síntesis quimioenzimática de una celohexaosida bifuncionalizada como sustrato específico para el ensayo sensible de la celulasa mediante desactivación fluorescente). Chemistry-a European Journal, 8 (6),1389-1394 (2002)

Resumen
Se sintetizó un nuevo derivado de una celohexaosa bifuncionalizada como sustrato específico para el ensayo continuo de las celulasas mediante transferencia de energía de resonancia. Esta celohexaosida tiene una molécula de naftaleno (EDANS) como donante de energía fluorescente en el extremo reductor y un derivado de 4-(4'- dimetilaminobenzeneazo)-benzeno como cromóforo aceptor en el extremo no reductor. Los pasos clave para la preparación de la molécula objetivo involucraron reacciones de transglucosilación de donantes de fluoruro de celobiosil y de celotetraosil en aceptores de celobiosil catalizados mediante el mutante E197A de celulasa Cel7B obtenida del Humicola insolens. Tras la digestión con varias celulasas, se alteró la transferencia de energía y se observó un aumento de la fluorescencia.


S.F. Lassen; J. Breinholt; P.R. Østergaard; R. Brugger; A. Bischoff; M. Wyss; C.C. Fuglsang.
“Expression, Gene Cloning, and Characterization of Five Novel Phytases from Four Basidiomycete Fungi: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, a Ceriporia sp., and Trametes pubescens”
(Expresión, clonación genética y caracterización de cinco fitasas novedosas de cuatro hongos basidiomicetos: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, una especie de Ceriporia y Trametes pubescens). Appl. Environ. Microbiol., 67, 4701-4707 (2001)

Resumen
Las fitasas catalizan la hidrólisis de las uniones de fosfomonoésteres de fitatos (mioinositol hexaquisfosfato) y, de ese modo, crean formas inferiores de mioinositol fosfatos y fosfato inorgánico. En este estudio, se construyeron genotecas de expresión de ADNc a partir de cuatro hongos basidiomicetos (Peniophora lycii, Agrocybe pediades, una especie de Ceriporia y Trametes pubescens) y se realizaron análisis para detectar actividad de fitasas en las levaduras. Se aisló un ADNc que codifica fitasas de longitud completa de cada genoteca, salvo de la genoteca de Ceriporia sp., en la que se encontraron dos ADNc diferentes que codificaban fitasas. Las cinco fitasas se expresaron en el Aspergillus oryzae, se purificaron y caracterizaron. Las fitasas revelaron una temperatura óptima de entre 40 y 60 °C y un pH óptimo de entre 5,0 y 6,0, salvo para la fitasa del P. lycii, que tiene un pH óptimo de 4,0 a 5,0. Exhibieron actividades específicas en el rango de 400 a 1200 U/mg de proteína(-1) y fueron capaces de hidrolizar el fitato hasta reducirlo a mioinositol monofosfato. Lo que sorprendió es que el análisis por resonancia magnética nuclear H 1 de la hidrólisis del fitato por parte de las cinco fitasas de basidiomicetos demostró una preferencia por el ataque inicial en el grupo de 6 fosfatos de ácido fítico, una característica que, hasta el momento, se creía que no se observaba con fitasas fúngicas. Por consiguiente, las fitasas de basidiomicetos que se describen aquí deben agruparse como 6 fitasas (EC 3.1.3.26).


M. Skjøt; S. Kauppinen; L.V. Kofod; C.C.Fuglsang, M. Pauly; H. Dalbøge; L.N. Andersen.
“Functional cloning of an endo-arabinanase from Aspergillus aculeatus and its heterologous expression in A. oryzae and tobacco”
(Clonación funcional de una endoarabinanasa del Aspergillus aculeatus y su expresión heteróloga en el A. oryzae y el tabaco). Mol. Genet. Genomics, 265, 913-921 (2001)

Resumen
La clonación funcional en la levadura se ha usado para aislar ADNc de longitud completa que codifican una endo-alfa-1,5-L-arabinanasa del hongo filamentoso Aspergillus aculeatus. La detección de una genoteca de ADNc construida en un vector de expresión de levaduras para transformantes que hidrolizaron AZCL-arabinana identificó 44 clones de Saccharomyces cerevisiae que albergaban el mismo ADNc que codificaba arabinanasa. El ADNc clonado se expresó en el A. oryzae y la enzima recombinante se purificó y caracterizó. El modo de acción de la enzima se estudió mediante el análisis del patrón de digestión hacia la arabinana desramificada. El perfil de digestión que se obtuvo sugiere enfáticamente que la enzima es una endoarabinanasa. Además, se investigó la viabilidad del uso de Nicotiana tabacum como huésped alternativo para la expresión de arabinanasa.


M. Pauly; L.N. Andersen; S. Kauppinen; L.V. Kofod; W.S. York; P. Albersheim; A. Darvill.
“A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme”
(Una endo-beta-1,4-glucanasa específica del xiloglucano del Aspergillus aculeatus: clonación de expresión en levadura, purificación y caracterización de la enzima recombinante). Glycobiology, 9 (1), 93-100 (1999)

Resumen
Se ha aislado ADNc de longitud completa que codifica una endo-beta-1,4-glucanasa específica del xiloglucano (XEG) del hongo filamentoso Aspergillus aculeatus mediante la clonación de expresión en levadura. Las colonias que expresan la XEG funcional se identificaron en placas de agar que contenían xiloglucano entrecruzado teñido con azurina. La XEG que codificaba ADNc se aisló, secuenció, clonó en un vector de expresión de Aspergillus y se transformó en Aspergillus oryzae para la expresión heteróloga. Se purificó la enzima recombinante hasta lograr homogeneidad aparente mediante cromatografía de intercambio aniónico y de permeación en gel. La XEG recombinante tiene una masa molecular de 23 600, un punto isoeléctrico de 3,4 y tiene estabilidad óptima con un pH de 3,4 y una temperatura inferior a los 30 °C. La enzima hidroliza xiloglucanos de diversas estructuras de varias fuentes, pero no hidroliza ningún otro componente de la pared celular y, por lo tanto, puede considerarse una endo-beta-1,4-glucanohidrolasa específica de los xiloglucanos. La XEG hidroliza sus sustratos con retención de la configuración anomérica. La Km de la enzima recombinante es de 3,6 mg/ml, y su actividad específica es de 260 micromoles/min por mg de proteína. Se analizó la enzima para determinar su capacidad de solubilizar oligosacáridos xiloglucanos de las paredes celulares de las plantas. Se demostró que el tratamiento de las paredes celulares de las plantas con XEG produce solo oligosacáridos xiloglucanos, lo que indica que esta enzima puede ser una herramienta poderosa para la elucidación estructural de los xiloglucanos.