Micheelsen, P.O., Østergaard, P.R., Lange, L., Skjøt, M.
“High-level expression of the native barley α-amylase/subtilisin inhibitor in Pichia pastoris”
(Expresión de alto nivel del inhibidor de α-amilasa/subtilisina de la cebada natural en Pichia pastoris). Journal of Biotechnology, 133 (4), pp. 424-432. (2008)

Resumen

Se ha desarrollado un sistema de expresión para la expresión de alto nivel del inhibidor de α-amilasa/subtilisina de Hordeum vulgare natural (BASI) en Pichia pastoris, por medio de un promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) inducible por metanol. Para optimizar la expresión, se han diseñado dos regiones codificantes con optimización de codones y se han expresado junto con la región codificante natural. A fin de asegurar la secreción de la proteína madura natural, se utilizó una versión truncada de la señal de secreción del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae. Con el objetivo de poder comparar los niveles de expresión de los diferentes clones, se seleccionaron a través de PCR los transformadores de inserción única generados por el reemplazo de genes del gen de AOX1. Después de la inducción por metanol, los niveles de expresión alcanzaron los 125 mg L-1 de la región codificante natural, en tanto la expresión de las dos variantes con optimización de codones alcanzó los 65 y 125 mg L-1, respectivamente. La proteína se purificó y caracterizó mediante degradación de Edman, cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas y un ensayo de almidón azul insoluble, y mostró que poseía las mismas características que la proteína natural purificada de granos de cebada. © 2007 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Hamann, T., Lange, L.
“Discovery, cloning and heterologous expression of secreted potato proteins reveal erroneous pre-mRNA splicing in Aspergillus oryzae”
(El descubrimiento, el clonado y la expresión heteróloga de proteínas de papa secretadas revela un corte y empalme de pre-mRNA erróneo en Aspergillus oryzae). Journal of Biotechnology, 126 (3), pp. 265-276. (2006)

Resumen

Se utilizó una novedosa tecnología de captación de señales asistida por transposones (transposon assisted signal trapping, TAST) desarrollada para seleccionar específicamente solo las proteínas secretadas con el fin de descubrir novedosas proteínas vegetales extracelulares de Solarium tuberosum infectada con Phytophthora infestans. El análisis de 384 objetivos proporcionó 191 secuencias de P. infestans y S. tuberosum de proteínas secretadas, con aproximadamente 2/3 de estas con origen en la papa. Se llevó a cabo una evaluación posterior de los genes de interés utilizando bioinformática. Se presenta una variedad seleccionada de las secuencias descubiertas, incluida una xiloglucano endotransglucosilasa (StXTH) novedosa de S. tuberosum, que se clonó y sometió a estudios detallados de la expresión heteróloga en Aspergillus oryzae. El análisis de PCR en tiempo real (RT-PCR) del mRNA de los transformadores de StXTH1 de A. oryzae reveló que partes del grupo de mRNA se habían procesado incorrectamente, y solo se pudieron detectar indicaciones inconsistentes de la proteína activa. El alto contenido de AT de StXTH1 y la aparición de sitios de reconocimiento del punto de ramificación, aceptor y donante de intrones de A. oryzae generó una interpretación errónea de los intrones (intrones crípticos) de las partes de la secuencia codificante de mRNA. Esto podría explicar las dificultades que se experimentaron generalmente al expresar los genes vegetales en el hongo filamentoso. © 2006 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Herzberg, K., Bashkirov, V.I., Rolfsmeier, M., Haghnazari, E., McDonald, W.H., Anderson, S., Bashkirova, E.V., Yates III, J.R., Heyer, W.-D.
“Phosphorylation of Rad55 on serines 2, 8, and 14 is required for efficient homologous recombination in the recovery of stalled replication forks”
(Se requiere la fosforilación de Rad55 en serinas 2, 8 y 14 para la recombinación homóloga eficiente en la recuperación de horquillas de replicación detenidas). Molecular and Cellular Biology, 26 (22), pp. 8396-8409. (2006)

Resumen

Los puntos de control de daños del ADN coordinan la respuesta celular al estrés genotóxico y detienen el ciclo celular en respuesta a los daños en el ADN y al bloqueo de la horquilla de replicación. La recombinación homóloga es una forma muy extendida de reparar las roturas de doble cadena y otras lesiones que inducen los puntos de control. Asimismo, la recombinación homóloga interviene en la tolerancia postrreplicativa a los daños en el ADN y en la recuperación de la replicación del ADN tras un bloqueo de la horquilla de replicación. En este estudio, se demuestra que la fosforilación en las serinas 2, 8 y 14 (S2,8,14) de la proteína Rad55 se requiere específicamente para la supervivencia y para el crecimiento normal en condiciones de estrés genotóxico de todo el genoma. Rad55 es paráloga de Rad51 en Saccharomyces cerevisiae y funciona en el ensamblaje del filamento de Rad51, un intermediario central para la reparación recombinatoria del ADN. Los mutantes con defectos de fosforilación de Rad55 en las serinas S2,8,14A presentan un paso muy lento de la fase S en condiciones dañinas para el ADN, lo que probablemente se deba a la mayor lentitud de recuperación de las horquillas de replicación bloqueadas o a la mayor lentitud de reparación de los daños en el ADN asociados con la replicación. Estos resultados sugieren que la fosforilación de Rad55 en las serinas S2,8,14 activa la reparación recombinatoria, lo que permite una recuperación más rápida tras el estrés genotóxico. Copyright © 2006, American Society for Microbiology. Todos los derechos reservados.

 

Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Stöger, E., Arcalis, E., Pontopidan, K., Holm, P.B.
“Heat-stable phytases in transgenic wheat (Triticum aestivum L.): Deposition pattern, thermostability, and phytate hydrolysis” (Fitasas termoestables en el trigo transgénico [Triticum aestivum L.]: características de depósito, termoestabilidad e hidrólisis de fitatos)
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (13), págs. 4624-4632. (2006)

Resumen

En este artículo se aborda la cuestión de la termotolerancia de las enzimas heterógenas sintetizadas en la planta empleando la fitasa como modelo. Se evaluaron dos materiales separados de trigo transgénico que expresan una fitasa de Aspergillus fumigatus con una temperatura de desnaturalización baja (62,5 °C), pero con alta capacidad de repliegue, y una fitasa de consenso, racionalmente diseñada a una temperatura de desnaturalización alta (89,3 °C). Se garantizaron altos niveles de expresión específica del endosperma por parte del activador 1DX5 de glutenina de masa molecular elevada del trigo. La inmunodetección mediante microscopio óptico y electrónico demuestra sin lugar a dudas que la fitasa heterógena se deposita en la vacuola, aunque las estructuras de transformación se diseñaron para la secreción al apoplasto. La evaluación de las propiedades cinéticas y de termoestabilidad dejó en claro que, en estas condiciones de depósito, la termoestabilidad en función de una temperatura de despliegue alta es superior a la alta capacidad de repliegue y representa una estrategia realista para mejorar la biodisponibilidad de fosfatos y minerales en alimentos a base de cereales. © 2006 American Chemical Society.

 

C. Muller; C. M. Hjort; K. Hansen; J. Nielsen.
“Altering the expression of two chitin synthase genes differentially affects the growth and morphology of Aspergillus oryzae” (La alteración de la expresión de dos genes de quitina-sintasa afecta de manera diferencial el crecimiento y la morfología de Aspergillus oryzae)
Microbiology (Reading), 148 (12), 4025-4033 (2002)

Resumen

En Aspergillus oryzae se identificó una quitina-sintasa completa (chsB) y fragmentos de otras dos quitina-sintasas (csmA y chsC). La secuencia deducida de aminoácidos de chsB fue similar (identificación del 87 %) a la de chsB de Aspergillus nidulans, que codifica una quitina-sintasa de clase III. La secuencia que se obtuvo de csmA indicó un alto grado de similitud con las quitina-sintasas de clase V. Las cepas inactivadas con chsB y csmA, y una cepa en la que se controló la transcripción de chsB, se construyeron empleando el activador nitrito-reductasa (niiA). Las cepas se examinaron durante el crecimiento de la hifa mediante la técnica Northern, el análisis de la composición de la pared celular y el crecimiento en presencia de blanco de calcoflúor (Calcofluor White, CFW). La cepa inactivada con chsB y la cepa no inducida con p(niiA)-chsB presentaron hiperramificación, un nivel inferior de conidiación que la cepa natural, así como sensibilidad al CFW a 50 mg l(-1) Cuando se indujo la transcripción de chsB en la cepa que contenía el complejo p(niiA)-chsB, la cepa presentó morfología natural en un medio sólido y a una velocidad de crecimiento por debajo del máximo, pero la morfología natural no se restableció del todo durante el crecimiento rápido en el cultivo por lotes. La cepa inactivada con csmA presentó anomalías morfológicas, por ejemplo, células en globo, hifas intrahifales y cicatrices conidiales. El crecimiento se vio seriamente inhibido en presencia de 10 mg de CFW l(-1) La composición de la pared celular no se diferenció de la cepa natural en ninguna de las cepas construidas. El análisis mediante la técnica Northern no indicó ningún cambio en la transcripción de los genes de las quitina-sintasas csmA y chsC cuando se alteró la expresión de chsB, y no se observaron cambios en la transcripción de chsB y chsC cuando se inactivó csmA.

 

H. Pedersen; B. Christensen; C. Hjort; J. Nielsen.
“Construction and characterization of an oxalic acid nonproducing strain of Aspergillus niger” (Construcción y caracterización de una cepa de Aspergillus niger que no produce ácido oxálico)
Metab Eng, 2(1), 34-41 (2000)

Resumen

Aspergillus niger produce ácido oxálico como subproducto, lo que causa problemas con el procesamiento posterior de las enzimas industriales. A fin de resolver este problema, el gen oah que codifica la oxalacetato-hidrolasa (EC 3.7.1.1) se inactivó en una cepa productora de glucoamilasa de A. niger, y la cepa resultante fue incapaz de producir ácido oxálico. La cepa con el gen inactivado se comparó con la cepa natural que produce ácido oxálico en cultivos por lotes. La velocidad específica de crecimiento de ambas cepas fue de 0,20 h(-1). La producción de ácido cítrico fue idéntica, pero la producción de glucoamilasa fue de solo el 50 % en la cepa inactivada en comparación con la cepa natural. Se llevaron a cabo experimentos por lotes con glucosa marcada con 13C como sustrato para determinar los flujos metabólicos a través del metabolismo central. Ambas cepas presentaron flujos metabólicos prácticamente idénticos, lo que sugirió que era posible inactivar el gen oah sin efectos pleotrópicos. El flujo a través de la vía de la fosfopentosa fue de aproximadamente el 60 % de la absorción de la glucosa en ambas cepas, lo que sugirió que había un suministro suficiente de NADPH disponible para la biosíntesis.

 

P.L. Jørgense n; M. Tangney; P.E. Pedersen; S. Hastrup ; B. Diderichsen; S.T. Jørgensen.
“Cloning and sequencing of an alkaline protease gene from Bacillus lentus and amplification of the gene on the B. lentus chromosome by an improved technique” (Clonación y secuenciación de un gen de una proteinasa alcalina de Bacillus lentus y amplificación del gen en el cromosoma de B. lentus mediante una técnica mejorada)
Appl. Environ. Microbiol. 66, 825-827 (2000)

Resumen

Un gen que codifica una proteinasa alcalina (subtilisina), comercialmente conocida como Savinase®, se clonó a partir de la cepa NCIB 10309 de Bacillus lentus alcalófilo en DN497 de B. subtilis, y se determinó su secuencia de nucleótidos. El gen clonado se utilizó para aumentar el número de copias del gen de la proteinasa en el cromosoma. A partir de estos estudios, se mejoró una técnica genética para la integración y la amplificación de genes empleando el plásmido termosensible pE194.

 

K. L. Petersen; J Lehmbeck; T. Christensen.
“A new transcriptional activator for amylase genes in Aspergillus” (Un nuevo activador de transcripción para los genes de la amilasa en Aspergillus)
Mol Gen Genet, 262, 668-676 (1999)

Resumen

Se clonó un gen regulador para la síntesis de la amilasa en Aspergillus oryzae. Este gen, amyR, codifica un activador de transcripción de 604 aminoácidos con un grupo de zinc Cys6, lo que demuestra una homología extensa con el dominio de unión al ADN de GAL4 de Saccharomyces cerevisiae. El dominio de unión al ADN de amyR se une a dos tipos de secuencias que se encuentran en varios activadores de genes de Aspergillus que codifican las enzimas que degradan el almidón. Un tipo de punto de unión se caracteriza por dos codones CGG separados por ocho nucleótidos. El otro tipo tiene un solo codón CGG, seguido de la secuencia AAATTTAA.