Vongsangnak, W., Olsen, P., Hansen, K., Krogsgaard, S., Nielsen, J.
“Improved annotation through genome-scale metabolic modeling of Aspergillus oryzae”
(Anotación mejorada por medio del modelado metabólico a escala del genoma del Aspergillus oryzae). BMC Genomics, 9, art. n.° 245. (2008)

Resumen

Antecedentes: El hongo filamentoso Aspergillus oryzae se ha usado desde tiempos inmemoriales en la industria de la fermentación para la producción de salsas fermentadas y enzimas industriales. Recientemente, se publicó la secuencia genómica del A. oryzae con 12 074 genes anotados, pero la cantidad de proteínas hipotéticas representó más del 50 % de los genes anotados. Por lo tanto, tomando en cuenta la importancia industrial de este hongo, es valioso mejorar la anotación e integrar aún más la información genómica con la información bioquímica y fisiológica disponible para este microorganismo y otros hongos relacionados. En este punto, propusimos la predicción genética mediante la construcción de una genoteca, la secuenciación y el ensamble de etiquetas de secuencias expresadas (Expressed Sequence Tag, EST) del A. oryzae. Mejoramos la asignación de funciones con la estrategia de anotación que desarrollamos. La mejor anotación que se obtuvo como resultado se usó para reconstruir la red metabólica que condujo a un modelo metabólico a escala del genoma del A. oryzae. Resultados: En nuestras secuencias de EST ensambladas identificamos 1046 genes recientemente predichos en el genoma del A. oryzae. Además, fue posible asignar funciones de proteínas putativas a 398 de los genes recientemente predichos. Cabe destacar que nuestra estrategia de anotación arrojó como resultado la asignación de nuevas funciones putativas a 1469 proteínas hipotéticas que ya estaban presentes en la base de datos del genoma del A. oryzae. Usando el genoma anotado considerablemente mejorado, reconstruimos la red metabólica del A. oryzae. Esta red contiene 729 enzimas, 1314 genes codificadores de enzimas, 1073 metabolitos y 1846 reacciones bioquímicas (1053 únicas). Las reacciones metabólicas se compartimentan en el citosol, las mitocondrias, el peroxisoma y el espacio extracelular. Los pasos de transporte entre los compartimientos y el espacio extracelular representan 281 reacciones, de las cuales 161 son únicas. Se validó el modelo metabólico y este demostró describir correctamente el comportamiento fenotípico del A. oryzae cultivado en diferentes fuentes de carbono. Conclusión: Se realizó una anotación muy mejorada del genoma del A. oryzae y se reconstruyó un modelo metabólico a escala del genoma del A. oryzae. El modelo predijo con precisión el crecimiento y la biomasa obtenidos en diferentes fuentes de carbono. El modelo sirve como recurso importante para obtener una visión más profunda de nuestra comprensión de la fisiología del A. oryzae. © 2008 Vongsangnak et al; titular de licencia: BioMed Central Ltd.

 

Martinez, D., Berka, R.M., Henrissat, B., Saloheimo, M., Arvas, M., Baker, S.E., Chapman, J., Chertkov, O., Coutinho, P.M., Cullen, D., Danchin, E.G.J., Grigoriev, I.V., Harris, P., Jackson, M., Kubicek, C.P., Han, C.S., Ho, I., Larrondo, L.F., De Leon, A.L., Magnuson, J.K., Merino, S., Misra, M., Nelson, B., Putnam, N., Robbertse, B., Salamov, A.A., Schmoll, M., Terry, A., Thayer, N., Westerholm-Parvinen, A., Schoch, C.L., Yao, J., Barbote, R., Nelson, M.A., Detter, C., Bruce, D., Kuske, C.R., Xie, G., Richardson, P., Rokhsar, D.S., Lucas, S.M., Rubin, E.M., Dunn-Coleman, N., Ward, M., Brettin, T.S.
“Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecorina)”
(Secuenciación de genomas y análisis del hongo degradador de biomasa Trichoderma reesei [sin. Hypocrea jecorina]). Nature Biotechnology, 26 (5), págs. 553-560. (2008)

Resumen
El Trichoderma reesei es la principal fuente industrial de celulasas y hemicelulasas que se emplean para despolimerizar la biomasa en azúcares simples que se convierten en intermediarios químicos y biocombustibles, como el etanol. Ensamblamos 89 soportes (conjuntos de cóntigos ordenados y orientados) para generar 34 Mbp de secuencias del genoma del T. reesei casi contiguas que comprenden 9129 modelos de genomas predichos. De forma imprevista, tomando en cuenta la utilidad industrial y la efectividad de las enzimas de carbohidratos activos del T. reesei, su genoma codifica menos celulasas y hemicelulasas que cualquier otro hongo secuenciado capaz de hidrolizar polisacáridos de las paredes celulares de las plantas. Muchos genes del T. reesei que codifican enzimas de carbohidratos activos se distribuyen de manera no aleatoria en grupos que yacen entre las regiones de sintenia con otros Sordariomycetes. Varios genes que codifican rutas biosintéticas para metabolitos secundarios pueden promover la supervivencia del T. reesei en su hábitat de suelo competitivo, pero el análisis de genomas proporcionó una escasa visión del mecanismo de su extraordinaria capacidad de secreción de proteínas. Nuestro análisis, junto con los datos de la secuencia de genomas, proporciona un mapa para la construcción de cepas de T. reesei mejoradas para aplicaciones industriales, como la producción de biocombustible.

 

David, H., Özçelik, I.Ş., Hofmann, G., Nielsen, J.
“Analysis of Aspergillus nidulans metabolism at the genome-scale”
(Análisis del metabolismo de Aspergillus nidulans a escala del genoma). BMC Genomics, 9, art. n.° 163. (2008)

Resumen

Antecedentes: El Aspergillus nidulans es miembro de un grupo diverso de hongos filamentosos y comparte muchas de las propiedades de sus parientes cercanos, con importancia en los campos de la medicina, la agricultura y la industria. Además, el A. nidulans ha sido un organismo de modelo clásico para estudios de biología del desarrollo y regulación de genes y, por lo tanto, se ha convertido en uno de los hongos filamentosos mejor caracterizados. Fue la primera especie de la familia Aspergillus a la que se le secuenció el genoma, y las herramientas de predicción de genes automatizadas predijeron 9451 marcos abiertos de lectura (open reading frames, ORF) en el genoma, de los cuales se les asignó una función a menos del 10 %. Resultados: En este trabajo, hemos asignado funciones manualmente a 472 genes huérfanos en el metabolismo del A. nidulans, mediante el uso de un enfoque impulsado por rutas y el empleo de herramientas genómicas comparativas basadas en la similaridad de las secuencias. El metabolismo central del A. nidulans, así como las rutas biosintéticas de metabolitos secundarios relevantes, se reconstruyó sobre la base de las reconstrucciones metabólicas detalladas disponibles para el A. niger y Saccharomyces cerevisiae, e información sobre la genética, bioquímica y fisiología del A. nidulans. Por lo tanto, fue posible identificar funciones metabólicas sin un gen asociado y buscar ORF candidatos en el genoma del A. nidulans mediante la comparación de su secuencia con las secuencias de genes bien caracterizados en otras especies que codifican la función de interés. Se desarrolló un sistema de clasificación, basado en criterios definidos, para la evaluación y la selección de los ORF entre los candidatos, de una manera objetiva y sistemática. Las asignaciones de funciones sirvieron como base para desarrollar un modelo matemático y vincular 666 genes (anotados anteriormente y recientemente anotados) a funciones metabólicas. Se utilizó el modelo para simular el comportamiento metabólico y, además, para integrar, analizar e interpretar datos de expresión de genes a gran escala con respecto a un estudio de represión de glucosa; de este modo, se proporcionó un medio para subir de nivel el contenido de información de datos experimentales y obtener una visión más profunda de este fenómeno en el A. nidulans. Conclusión: Demostramos cómo el modelado de rutas del A. nidulans puede usarse como enfoque para mejorar la anotación de funciones del genoma de este organismo. Además, mostramos cómo el modelo metabólico establece vínculos funcionales entre los genes, lo que permite el aumento de nivel del contenido de información de datos de transcriptomas. © 2008 David et al; titular de licencia: BioMed Central Ltd.

 

Baker, S.E., Thykaer, J., Adney, W.S., Brettin, T.S., Brockman, F.J., D'haeseleer, P., Martinez, A.D., Miller, R.M., Rokhsar, D.S., Schadt, C.W., Torok, T., Tuskan, G., Bennett, J., Berka, R.M., Briggs, S.P., Heitman, J., Taylor, J., Gillian Turgeon, B., Werner-Washburne, M., Himmel, M.E.
“Fungal genome sequencing and bioenergy”
(Secuenciación de genomas de hongos y bioenergía). Fungal Biology Reviews, 22 (1), págs. 1-5. (2008)

Resumen

Hasta la fecha, la cantidad de proyectos de secuenciación de genomas de hongos filamentosos que se encuentran en curso es casi diez veces menor que la cantidad de proyectos de genomas de bacterias y arqueobacterias. Los hongos escogidos para su secuenciación representan una diversidad acotada de reinos; la mayoría de estos son patógenos o modelos. Abogamos por un programa de secuenciación de genomas basado en la filogenia que sea ambicioso y proyectado hacia el futuro, diseñado para capturar la diversidad metabólica dentro del reino de los hongos y que, de ese modo, mejore la investigación de fuentes alternativas de bioenergía, biorremediación e interacciones en el ambiente de los hongos.

 

Oh, Y.-K., Palsson, B.O., Park, S.M., Schilling, C.H., Mahadevan, R.
“Genome-scale reconstruction of metabolic network in Bacillus subtilis based on high-throughput phenotyping and gene essentiality data”
(Reconstrucción a escala del genoma de la red metabólica del Bacillus subtilis basada en datos de la esencialidad de los genes y fenotipado de gran productividad). Journal of Biological Chemistry, 282 (39), págs. 28791-28799. (2007)

Resumen

En este informe, se presenta una reconstrucción a escala del genoma del metabolismo del Bacillus subtilis y su desarrollo repetitivo basado en la combinación de información genómica, bioquímica y fisiológica, y experimentos de fenotipado de gran producción. La reconstrucción inicial fue convertida en un modelo informático y se expandió de manera repetitiva en cuatro pasos. En primer lugar, se usó un análisis del espacio de la red para identificar 48 reacciones faltantes que se necesitan para el crecimiento, pero que no se encontraron en la anotación del genoma. En segundo lugar, se compararon las velocidades de crecimiento computadas en condiciones aeróbicas con los datos de la detección de fenotipos de gran producción, y el modelo informático inicial pudo predecir los resultados de forma cualitativa en 140 de los 271 casos que se consideraron. El análisis detallado de las predicciones incorrectas arrojó como resultado la adición de 75 reacciones a la reconstrucción inicial, y se computaron correctamente 200 de los 271 casos. En tercer lugar, se halló que los cómputos informáticos de los fenotipos de crecimiento de cepas bloqueadas eran coherentes con las observaciones experimentales en 720 de los 766 casos evaluados. En cuarto lugar, el análisis integrado del uso de sustratos a gran escala y los datos de esencialidad de los genes con el modelo metabólico a escala del genoma reveló el requerimiento de 80 enzimas específicas (transporte, 53; reacciones intracelulares, 27) que no estuvieron en la anotación de genomas. El análisis de secuencias posterior arrojó como resultado la identificación de genes que podrían asignarse de forma putativa a 13 enzimas intracelulares. La reconstrucción final dio cuenta de 844 marcos abiertos de lectura y constó de 1020 reacciones metabólicas y 988 metabolitos. Por lo tanto, el modelo informático puede usarse para obtener hipótesis verificables desde el punto de vista experimental en las funciones metabólicas de diversos genes. © 2007 de The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

 

Tang, M.R., Sternberg, D., Behr, R.K., Sloma, A., Berka, R.M.
“Use of transcriptional profiling & bioinformatics to solve production problems”
(Uso de determinación de perfil transcripcional y bioinformática para resolver problemas de producción). Industrial Biotechnology, 2 (1), págs. 66-74. (2006)

Resumen

La producción de pigmentos durante las fermentaciones industriales es poco conveniente, y a menudo se requieren pasos de purificación costosos para eliminar compuestos de color de productos comerciales previstos. Observamos que una cepa recombinante del Bacillus subtilis que sintetiza el polisacárido heterólogo ácido hialurónico (HA) produjo una cantidad abundante de pigmento rojo con propiedades bioquímicas características de la pulquerrimina, una pirazina anteriormente caracterizada que se une al hierro. Se aisló un mutante del B. subtilis apigmentado tras mutagénesis química y se comparó con su cepa original por medio de análisis de transcriptomas de micromatrices de ADN. Entre los genes cuya transcripción se vio alterada de forma considerable (p < 0,05) en el mutante apigmentado, se seleccionaron el yvmC y cypX como probables genes biosintéticos de la pulquerrimina sobre la base del examen bioinformático que sugirió que el producto del gen yvmC contiene un dominio de fosfopanteteína putativo de algunas sintasas de péptidos cíclicos, y el gen cypX codifica una enzima similar al citocromo P450. Anteriormente se propuso que la biosíntesis de la pulquerrimina se producía por medio de la ciclización de dos moléculas de leucina, seguida de una reacción de reducción-oxidación que utiliza oxígeno molecular. Además, los genes yvmC y cypX están yuxtapuestos en el cromosoma del B. subtilis y parecen estar expresados de forma coordinada en función de análisis de grupos jerárquicos de datos de micromatrices. Tras la alteración de los genes yvmC o cypX, se originaron cepas que no produjeron pigmento rojo. Este estudio ilustra que la combinación de la determinación de perfiles transcripcionales y la bioinformática es un enfoque efectivo que puede emplearse para resolver problemas de fermentación industrial.

 

Woods, K., Hilu, K.W., Borsch, T., Wiersema, J.H.
“Pattern of variation and systematics of Nymphaea odorata: II. Sequence information from ITS and trnL-trnF”
(Patrón de variación y sistemática de Nymphaea odorata: II. Información de secuencias de ITS y trnL-trnF). Systematic Botany, 30 (3), págs. 481-493. (2005)

Resumen

Se usaron los datos de secuencias de las regiones del espaciador interno transcrito (internal transcribed spacer, ITS) nuclear y del plástido trnL-trnF para evaluar relaciones entre poblaciones de N. odorata en todo su rango norteamericano, y para evaluar si la subespecie odorata y la subespecie tuberosa forman unidades taxonómicas distintas. Se incluyó la Nymphaea mexicana debido a la sospecha de hibridización con N. odorata. La región trnL-trnF proporcionó un único lugar informativo en la N. odorata. En contraste, la región del ITS fue más variable. El análisis filogenético de los datos del ITS respalda la monofilia de las dos especies. Dentro de la N. odorata, se resolvieron dos subtipos que representaban en gran medida la subespecie odorata y la subespecie tuberosa si bien unos pocos individuos aparecieron por fuera de los subtipos respectivos. Se detectaron lugares polimórficos en el ITS, lo que indicó una posible hibridación entre las subespecies. La ubicación geográfica de estos híbridos sugiere una posible zona híbrida. En general, la evidencia molecular respalda la separación de las subespecies odorata y tuberosa, con un flujo de genes limitado entre estas. © Copyright 2005 de American Society of Plant Taxonomists.

 

Lin, J.T., Connelly, M.B., Amolo, C., Otani, S., Yaver, D.S.
“Global transcriptional response of Bacillus subtilis to treatment with subinhibitory concentrations of antibiotics that inhibit protein synthesis”
(Respuesta transcripcional mundial del Bacillus subtilis al tratamiento con concentraciones subinhibitorias de antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49 (5), págs. 1915-1926. (2005)

Resumen

Se estudiaron los patrones de expresión de genes mundiales del Bacillus subtilis en respuesta a concentraciones subinhibitorias de inhibidores de la síntesis de proteínas (cloranfenicol, eritromicina y gentamicina) mediante el análisis de micromatrices de ADN. Se trataron cultivos de B. subtilis con concentraciones subinhibitorias de inhibidores de la síntesis de proteínas durante 5, 15, 30 y 60 min, y se midieron los patrones transcripcionales durante todo el transcurso del tiempo. Tres clases importantes de genes se vieron afectadas por los inhibidores de la síntesis de proteínas: genes que codifican proteínas de transporte/unión, genes que participan en la síntesis de proteínas, y genes que participan en el metabolismo de los carbohidratos y moléculas relacionadas. Se observaron patrones de expresión similares en algunas clases de genes debido al tratamiento con cloranfenicol (0,4x MIC) o eritromicina (0,5x MIC), mientras que los patrones de expresión de las células tratadas con gentamicina fueron distintos. La expresión de los genes que participan en el metabolismo de los aminoácidos se vio alterada por el tratamiento con cloranfenicol y eritromicina, pero no por el tratamiento con gentamicina. La gentamicina introdujo genes de choque térmico pero el cloranfenicol los rechazó. Entre los otros genes que se introdujeron con los inhibidores de la síntesis de proteínas, se incluyeron el operón yheIH, que codifica proteínas similares a la transportadora de ABC, con similitud con las proteínas de eflujo multifármaco, y el operón ysbAB, que codifica homólogos de LrgAB que funcionan para inhibir la ruptura de la pared celular (actividad de mureína hidrolasa) y expresan la tolerancia a la penicilina del Staphylococcus aureus. Copyright © 2005, American Society for Microbiology. Todos los derechos reservados.

 

Rey, M.W., Ramaiya, P., Nelson, B.A., Brody-Karpin, S.D., Zaretsky, E.J., Tang, M., Lopez de Leon, A., Xiang, H., Gusti, V., Clausen, I.G., Olsen, P.B., Rasmussen, M.D., Andersen, J.T., Jørgensen, P.L., Larsen, T.S., Sorokin, A., Bolotin, A., Lapidus, A., Galleron, N., Ehrlich, S.D., Berka, R.M.
“Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species”
(Secuencia completa del genoma de la bacteria industrial Bacillus licheniformis y comparaciones con especies de Bacillus estrechamente relacionadas). Genome biology, 5 (10), págs. R77. (2004)

Resumen

ANTECEDENTES: El Bacillus licheniformis es una bacteria gram positiva del suelo que forma esporas y que se usa en la industria de la biotecnología para fabricar enzimas, antibióticos y productos de consumo. Esta especie está estrechamente relacionada con el organismo modelo estudiado en profundidad Bacillus subtilis y produce una variedad de enzimas extracelulares que pueden contribuir al ciclo de nutrientes en la naturaleza. RESULTADOS: Determinamos la secuencia completa de nucleótidos del genoma del B. licheniformis ATCC 14580, que comprende un cromosoma circular de 4 222 336 de pares de bases (bp) que contienen 4208 genes codificadores de proteínas predichos con un tamaño promedio de 873 bp, siete operones de ARNr y 72 genes de ARNt. El cromosoma del B. licheniformis contiene grandes regiones que son colineales con los genomas del B. subtilis y del Bacillus halodurans, y aproximadamente el 80 % de las secuencias de codificación predichas del B. licheniformis tienen ortólogos del B. subtilis. CONCLUSIONES: A pesar de las similitudes organizacionales inconfundibles entre los genomas del B. licheniformis y del B. subtilis, hay diferencias notables en las cantidades y las ubicaciones de los profagos, los transposones y una cantidad de enzimas extracelulares y operones secundarios de la ruta metabólica que distinguen estas especies. Entre las diferencias se incluyen una región de más de 80 kilobases (kb) que comprende un conjunto de genes de poliquétido sintasa y un segundo operón de 38 kb que codifica enzimas plipastatina sintasa que están ausentes en el genoma del B. licheniformis. La disponibilidad de una secuencia completa de genoma del B. licheniformis debe facilitar el diseño y la construcción de mejores cepas industriales y permitir estudios comparativos de genómica y evolución dentro de este grupo de Bacillaceae.

 

Martinez, D., Larrondo, L.F., Putnam, N., Sollewijn Gelpke, M.D., Huang, K., Chapman, J., Helfenbein, K.G., Ramaiya, P., Detter, J.C., Larimer, F., Coutinho, P.M., Henrissat, B., Berka, R., Cullen, D., Rokhsar, D.
“Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78”
(Secuencia del genoma del hongo que degrada lignocelulosa Phanerochaete chrysosporium, cepa RP78). Nature Biotechnology, 22 (6), págs. 695-700. (2004)

Resumen

Los hongos de pudrición blanca degradan de forma eficiente la lignina, un polímero aromático complejo presente en la madera y que es uno de los materiales naturales más abundantes en la Tierra. Estos hongos usan enzimas oxidativas extracelulares que también pueden transformar compuestos aromáticos relacionados presentes en contaminantes explosivos, pesticidas y desechos tóxicos. Hemos secuenciado el genoma de 30 millones de pares de bases del Phanerochaete chrysosporium, cepa RP78, con el uso de un enfoque escopeta de genoma completo. El genoma del P. chrysosporium revela una gama impresionante de genes que codifican enzimas oxidasas, peroxidasas e hidrolíticas secretadas que colaboran a la descomposición de la madera. El análisis de los datos del genoma mejorará nuestros conocimientos sobre la degradación de la lignocelulosa, un proceso esencial en el ciclo global del carbono, y proporcionará un marco para desarrollar aún más los bioprocesos para la utilización de biomasa, la degradación de contaminantes orgánicos y el blanqueamiento de fibra. Este genoma proporciona una secuencia preliminar de alta calidad de un basidiomiceto, un filo fúngico importante que incluye importantes patógenos vegetales y animales.

 

Hansen, E.H., Schembri, M.A., Klemm, P., Schäfer, T., Molin, S., Gram, L.
“Elucidation of the Antibacterial Mechanism of the Curvularia Haloperoxidase System by DNA Microarray Profiling”
(Elucidación del mecanismo antibacteriano del sistema Curvularia haloperoxidasa mediante determinación de perfiles de micromatrices de ADN). Applied and Environmental Microbiology, 70 (3), págs. 1749-1757. (2004)

Resumen

Se examinó un novedoso sistema de enzimas antimicrobianas, el sistema Curvularia haloperoxidasa, con el objetivo de elucidar su mecanismo de acción antibacteriano. La cepa MG1655 de Escherichia coli fue sometida a condiciones extremas con concentraciones subletales del sistema de enzimas, lo que causó una detención temporal del crecimiento. Se analizó la expresión de los genes alterados con la exposición al sistema Curvularia haloperoxidasa por medio de micromatrices de ADN. Solo una cantidad limitada de genes estuvieron involucrados en la respuesta al sistema de Curpularia haloperoxidasa. Entre los genes introducidos se encontraron los genes ibpA e ibpB que codifican pequeñas proteínas de choque térmico, un conjunto de genes de seis genes (b0301 al b0306) de función desconocida y, por último, el cpxP, un miembro de la ruta Cpx. Se construyeron mutantes bloqueados con eliminaciones en b0301-b0306, cpxP y cpxARP, respectivamente. Solo el mutante al que le faltaba el cpxARP fue considerablemente más sensible al sistema de enzimas que el tipo natural. Nuestros resultados demuestran que no puede usarse tecnología de micromatrices de ADN como la única técnica para investigar los mecanismos de acción de nuevos compuestos antimicrobianos. Sin embargo, al combinar análisis de micromatrices de ADN con la posterior creación de mutantes bloqueados, pudimos señalar una de las respuestas específicas de E. coli, a saber, la ruta Cpx, que es importante para manejar la respuesta a condiciones extremas del sistema Curvularia haloperoxidasa.

R.M. Berka; B.A. Nelson; E.J. Zaretsky; W.T. Yoder; M.W. Rey.
“Genomics of Fusarium venenatum: an alternative fungal host for making enzymes” 
(Genómica del Fusarium venenatum: un huésped fúngico alternativo para producir enzimas). En Applied Mycology & Biotechnology, Vol. 4, Fungal Genomics (Arora, D.K. and Khachatourians, G.G., eds.) Elsevier Science, Amsterdam (2003)

Resumen

El Fusarium venenatum A3/5 (anteriormente llamado F. graminearum Schwabe A3/5) se ha usado desde 1985 como fuente comercial de la micoproteína Quorn™, una forma procesada de micelios fúngicos que se aplica a varios productos alimentarios para seres humanos para simular trozos de pollo o carne.  La aprobación regulatoria del organismo para el consumo humano lo convirtió en un un candidato atractivo para considerar como huésped en la producción de enzimas de grado industrial y alimentario. Se han desarrollado sistemas para la manipulación y la transformación genéticas de células del F. venenatum junto con varios promotores fuertes y marcadores seleccionables para la introducción y la expresión de genes heterólogos.  La comercialización reciente de una xilanasa heteróloga y una tripsina fúngica han proporcionado “prueba de concepto” del F. venenatum como alternativa útil a huéspedes fúngicos más tradicionales, como el Aspergillus niger o el A. oryzae.  Sin embargo, en comparación con los últimos organismos y los hongos modelo estudiados en profundidad, como el Neurospora crassa y el A. nidulans, la información con respecto a la genómica del F. venenatum es inadecuada.  Este capítulo proporciona una de las primeras descripciones generales de información genómica del F. venenatum sobre la base de una recopilación de etiquetas de secuencia expresadas y secuencias de genes cromosomales para iniciar el impulso para que se realicen más esfuerzos integrales para la secuenciación del genoma.

 

R.M. Berka; X. Cui; C. Yanofsky.
“Genome-wide transcriptional changes associated with genetic alterations and nutritional supplementation affecting tryptophan metabolism in Bacillus subtilis”
(Cambios transcripcionales de genoma entero asociados con alteraciones genéticas y suplementación nutricional que afecta el metabolismo triptófano del Bacillus subtilis). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 100, 5682-5687 (2003)

Resumen

Se desplegaron micromatrices de ADN que comprenden el 95 % de la proteína anotada del Bacillus subtilis que codifica ORF, para generar una serie de instantáneas de cambios transcripcionales de genoma completo que se producen cuando se cultivan células en diversas condiciones que se espera que aumenten o disminuyan la transcripción del segmento de operón trp del supraoperón aromático. Se realizaron comparaciones de patrones de expresión global entre las células cultivadas en presencia de ácido indolacrílico, un inhibidor específico de la carga de ARNt triptófano; células deficientes en cuanto a la expresión del gen mtrB, que codifica la proteína reguladora negativa activada por triptófano, TRAP; células naturales cultivadas en presencia o ausencia de dos o tres de los aminoácidos aromáticos; y células que albergan una mutación de la sintetasa de ARNt triptofanil que confiere el crecimiento dependiente del triptófano sensible a la temperatura. Nuestros hallazgos validan las respuestas esperadas de los genes biosintéticos triptófanos y presumieron interrelaciones regulatorias entre los genes de las diferentes rutas de aminoácidos aromáticos y la ruta biosintética de histidina. Mediante el uso de una combinación de métodos estadísticos supervisados y no supervisados, identificamos 100 genes cuyos perfiles de expresión estuvieron estrechamente correlacionados con los de los genes del operón de triptófano. Este hallazgo sugiere que la expresión de estos genes tiene influencia directa o indirecta de eventos regulatorios que afectan el metabolismo triptófano alterado o son una consecuencia de este.

 

C. Workman; L.J. Jensen; H. Jarmer; R. Berka; L. Gautier; H.H. Saxild; C. Nielsen; S. Brunak; S. Knudsen. 
“Methods to reduce variability in DNA microarray experiments”
(Métodos para reducir la variabilidad en los experimentos con micromatrices de ADN). Genome Biology, 3, 0048.1-0048.16 (2002)

Resumen

Los datos de las micromatrices están sujetos a varias fuentes de variación, de las cuales nos interesan las fuentes biológicas, mientras que la mayoría de las demás solo son fuentes de confusión. En un trabajo reciente se han identificado fuentes sistemáticas de variación que son de naturaleza dependiente de la intensidad y no lineal. Las fuentes sistemáticas de variación no se limitan a las diferentes propiedades de los tintes de cianina Cy5 y Cy3, como se observa en las matrices de ADNc, sino que son el caso general para los datos tanto de las micromatrices de oligonucleótidos (Affymetrix GeneChips) como de las micromatrices de ADNc. Las técnicas de normalización actuales suelen ser lineales y, por lo tanto, suelen no ser capaces de corregir estos efectos por completo.  Aquí presentamos un método no lineal simple y robusto para la normalización utilizando análisis de distribución de señales de matrices y curvas cúbicas. Estos métodos se compararon de forma favorable con la normalización mediante el uso de regresión lineal local robusta (Lowess). La aplicación de estos métodos a matrices de oligonucleótidos redujo el error relativo entre réplicas en un 5 % a un 10 % en comparación con un método de normalización global estándar. La aplicación a matrices de ADNc demostró mejoras con respecto al método estándar y a la normalización de Cy3-Cy5 en función de la replicación de intercambio de tintes. Además, la prueba t clasificó en un nivel más alto a un conjunto de genes conocidos regulados de manera diferencial. Ni en el ADNc ni en la tecnología Affymetrix el sesgo dependiente de la señal fue más de diez veces mayor que los efectos de la aguja (print-tip) o espaciales observados.  La normalización dependiente de la intensidad es importante tanto para los datos de matrices de oligonucleótidos de alta densidad como de las matrices de ADNc. Tanto el método de regresión como el método basado en la curva que se describen aquí tuvieron un mejor desempeño que los métodos lineales existentes cuando se los evaluó con respecto a la variabilidad de matrices replicadas. La normalización mediante intercambio de tintes fue menos efectiva para la normalización de Cy3-Cy5 que cualquiera de los métodos de regresión o basado en la curva por separado.

 

R.M. Berka; J. Hahn; I. Draskovic; M. Persuh; X. Cui; A. Sloma; W. Widner; D. Dubnau.
“Microarrray analysis of the Bacillus subtilis K-state: genome-wide expression changes induced by ComK”
(Análisis de micromatrices del estado K del Bacillus subtilis: cambios de expresión de genoma completo inducidos por ComK). Mol. Microbiol., 43, 1331-1345 (2002)

Resumen

En el Bacillus subtilis, el factor de transcripción de competencia ComK activa tanto su propia transcripción como la transcripción de genes que codifican proteínas de transporte de ADN. El ComK se expresa en, aproximadamente, el 10 % de las células de un cultivo realizado para la competencia. Con el uso de micromatrices de ADN que representaban el 95 % de los marcos abiertos de lectura codificadores de proteínas en el B. subtilis, comparamos los perfiles de expresión de las cepas naturales y comK, así como las de un mutante mecA (que produce ComK activo en todas las células de la población) y un mutante doble mecA comK. En estas comparaciones, identificamos al menos 165 genes que el ComK regula por incremento y relativamente pocos que son regulados por disminución. El uso de fusiones informantes ha confirmado estos resultados para varios genes. Muchos de los genes regulados por ComK se organizan en grupos u operones, y 23 de estos grupos son precedidos por motivos promotores de secuencias ComK aparentes. Además de los que se necesitan para la captación de ADN, probablemente estén involucrados otros genes que se regulan por incremento en presencia del ComK en la reparación del ADN y en la captación y utilización de fuentes nutricionales. A partir de este trabajo y trabajos anteriores, llegamos a la conclusión de que el regulón ComK define un estado de detención del crecimiento, distinto de la esporulación, cuya competencia para la transformación genética es una característica notable. Sugerimos que esta es una adaptación única a las condiciones extremas y que se debe denominar el “estado K”.

 

H. Jarmer; R. Berka; S. Knudsen; H.H. Saxild.
“Transcriptome analysis documents induced competence of Bacillus subtilis during nitrogen limiting conditions”
(Análisis de transcriptomas documenta la competencia inducida del Bacillus subtilis durante condiciones de nitrógeno restrictivas). FEMS Microbiol. Lett., 206, 197-200 (2002)

Resumen

Se usaron micromatrices de ADN para analizar los cambios en la expresión de genes del Bacillus subtilis, cepa 168, cuando se compararon condiciones de crecimiento con nitrógeno restrictivas (glutamato) y condiciones de crecimiento con nitrógeno en exceso (amonio más glutamato). Entre los más de 100 genes que se indujeron de forma significativa durante la falta de nitrógeno, detectamos las unidades de transcripción comG, comF, comE, nin-nucA y comK junto con recA. Se añadió ADN al B. subtilis cultivado en un medio mínimo con glutamato como única fuente de nitrógeno y se demostró que las células eran competentes. En función de estas observaciones, propusimos una simplificación de los procedimientos de transformación de un paso que habían sido diseñados anteriormente para el B. subtilis, cepa 168.