Faber, C., Hobley, T.J., Mollerup, J., Thomas, O.R.T., Kaasgaard, S.G.
“Factors affecting the solubility of Bacillus halmapalus α-amylase”
(Factores que afectan la solubilidad de la α-amilasa de Bacillus halmapalus). Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 47 (6), págs. 1007-1017. (2008)

Resumen

Se ha realizado un estudio detallado de la solubilidad de la α-amilasa recombinante de Bacillus halmapalus. Se eligió una preparación semipurificada de una cristalización a gran escala que contenía seis isoformas con valores de pH(I) de 5,5 a 6,1. La solubilidad se vio fuertemente afectada por el pH y se pudo reducir aproximadamente 200 veces a un pH de 6, en comparación con un pH de 10, lo que dejó solo 0,1 mg/mL en la solución. La solubilidad también se pudo manipular dramáticamente por medio de sales. Se halló que la elección de aniones fue más importante que la de cationes, y la solubilidad más baja se halló por medio del uso de sulfato de sodio. Para los aniones, la solubilidad siguió el orden previsto de la serie de Hofmeister series; sin embargo, se observó un comportamiento más complejo para los cationes. A excepción del litio, su eficiencia para influenciar la solubilidad fue inversa a lo que se preveía. La polidispersión de la solución se redujo mediante la adición de sal y las mediciones del potencial zeta indicaron un cambio en el pH(I) causado por el litio. Se discuten las posibles explicaciones de estas observaciones, lo que ayuda a ampliar nuestros conocimientos actuales sobre cómo las sales afectan la solubilidad de las proteínas, y unas de estas explicaciones hasta la fecha se basa en los experimentos con lisozima. © 2007 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Sonesson, A.W., Callisen, T.H., Brismar, H., Elofsson, U.M.
“Adsorption and activity of Thermomyces lanuginosus lipase on hydrophobic and hydrophilic surfaces measured with dual polarization interferometry (DPI) and confocal microscopy”
(Adsorción y actividad de la lipasa de Thermomyces lanuginosus en las superficies hidrofóbicas e hidrofílicas medidas con interferometría de polarización dual y microscopía confocal). Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 61 (2), págs. 208-215. (2008)


Resumen

Se midió la adsorción y actividad de la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL) mediante interferometría de polarización dual (dual polarization interferometry, DPI) y microscopía confocal en una superficie hidrofílica e hidrofóbica. En las isotermas de adsorción fue evidente que TLL tuvo mayor afinidad para la superficie hidrofóbica y adsorbió con una mayor cantidad de adsorción (1,90 mg/m2), en comparación con la superficie hidrofílica (1,40-1,50 mg/m2). El espesor de la capa adsorbida fue constante (∼3,5 nm) en ambas superficies con una cantidad adsorbida de >1,0 mg/m2, pero disminuyó en la superficie hidrofílica con mejor cobertura de superficie, lo que se podría explicar a través del despliegue parcial de la estructura de TLL. Sin embargo, la dependencia lineal del índice de refracción de la capa adsorbida en la cantidad adsorbida de TLL en las superficies C18 indicó que la estructura de TLL fue similar con una cobertura de superficie baja y alta. La actividad de la TLL adsorbida se midió en función del diacetato de carboxifluoresceína (carboxyfluorescein diacetate, CFDA) en la solución, que con la actividad de la lipasa formó un producto fluorescente. El aumento de intensidad de fluorescencia de la superficie se midió en un microscopio confocal como una función del tiempo después de la adsorción de la lipasa. Fue evidente que TLL fue más activa en la superficie hidrofílica, lo que sugirió que una fracción mayor de las moléculas de TLL adsorbidas se orientó con el sitio activo apuntando a la solución, en comparación con la superficie hidrofóbica. Asimismo, la mayor parte de la actividad se mantuvo cuando disminuyó la cobertura de la superficie de TLL. Los informes anteriores sobre la movilidad en la superficie de TLL en las mismas superficies han hallado que la difusión lateral fue más elevada en superficies hidrofílicas y en una cobertura de superficie baja de TLL. Por lo tanto, una mayor movilidad lateral podría provocar un mayor tiempo de exposición del sitio activo hacia la solución y, por lo tanto, podría aumentar la actividad, en comparación con un sustrato soluble en agua. © 2007 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Roca, M., De Maria, L., Wodak, S.J., Moliner, V., Tuñón, I., Giraldo, J.
“Coupling of the guanosine glycosidic bond conformation and the ribonucleotide cleavage reaction: Implications for barnase catalysis”
(Relación entre la conformación del enlace glucosídico de guanosina y la reacción de disociación de ribonucleótidos: implicancias para la catálisis de la barnasa). Proteins: Structure, Function and Genetics, 70 (2), págs. 415-428. (2008)

Resumen

Con el fin de evaluar la posible relación de las conformaciones de GpA dependientes de guanina con la disociación de ribonucleótidos, se realizaron dos cálculos del potencial de fuerza media (potential of mean force, PMF) en una solución acuosa. En el primer cálculo, el ángulo glucosídico de guanosina (Gχ) se utilizó como coordenada de reacción, y los cálculos se realizaron en dos especies iónicas de GpA: ribosa O2′ con guanosina protonada (neutral) o desprotonada (con carga negativa). Para ambas formas iónicas también se obtuvieron perfiles energéticos similares con dos valores mínimos que correspondieron a las regiones Gχ anti y syn. Para ambas formas, la conformación anti fue más estable que la syn, y se obtuvieron barreras de ∼4 kcal/mol para la transición de anti a syn. Los análisis estructurales mostraron una sensibilidad notable de la región de fosfato con respecto a la conformación del ángulo Gχ, lo que sugiere una conexión probable entre esta conformación y el mecanismo de disociación de ribonucleótidos. Esta hipótesis se confirmó a través de los segundos cálculos de PMF, para los cuales se utilizó la distancia de O2′-P para la GpA desprotonada como coordenada de reacción. Los cálculos se realizaron a partir de dos puntos de partida seleccionados: los valores mínimos anti y syn determinados en el primer estudio de PMF de la ribosa O2′ de guanosina desprotonada. Las simulaciones relevaron que el ataque de O2′ junto con Gχ syn fue más favorable que el que ocurrió junto con Gχ anti: se obtuvieron barreras energéticamente y significativamente más bajas en syn que en la conformación anti para la formación del enlace O-P; a nivel estructural, se observó una menor distancia inicial de O2′-P, y una mejor orientación adaptada para un ataque en línea en la conformación syn, en comparación con la conformación anti. Estos resultados coinciden con la conformación competente desde el punto de vista catalítico del complejo de barnasa-ribonucleótido, el cual requiere una conformación syn de guanina del sustrato para permitir la abstracción del protón de ribosa H2′ mediante la base general Glu73; por lo tanto, esto sugiere una relación entre la conformación del sustrato reactivo y la estructura y el mecanismo de la enzima. © 2007 Wiley-Liss, Inc.


Sonesson, A.W., Blom, H., Hassler, K., Elofsson, U.M., Callisen, T.H., Widengren, J., Brismar, H.
“Protein-surfactant interactions at hydrophobic interfaces studied with total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS)”
(Interacciones entre tensioactivos y proteínas en las interfaces hidrofóbicas estudiadas a través de espectroscopia de correlación de fluorescencia con reflexión interna total). Journal of Colloid and Interface Science, 317 (2), págs. 449-457. (2008)

Resumen

El objetivo de este trabajo era estudiar la dinámica de las proteínas cercanas a superficies sólidas con o sin tensioactivos competidores por medio de espectroscopia de correlación de fluorescencia con reflexión interna total (total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy, TIR-FCS). Se estudiaron dos proteínas diferentes, la albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, BSA) y la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL). Se utilizó una composición de tensioactivo no iónico/aniónico (C12E6/LAS) para imitar una formación de detergente, y las superficies utilizadas fueron vidrio C18. Se halló que con mayores concentraciones de tensioactivo, disminuyó el término en la función de autocorrelación (ACF) que representa la fijación en la superficie. Esto sugirió que el tensioactivo compitió con las proteínas hasta eliminarlas de la superficie hidrofóbica. Al adaptar la ACF medida a un modelo para la cinética de superficie, se observó que con una mayor concentración de C12E6/LAS, la tasa de interacción de la superficie aumentó para ambas proteínas. En estas condiciones experimentales, esto significó que se redujo el tiempo que la proteína estuvo unida a la superficie. Con 10 μM de C12E6/LAS, la interacción de la superficie no fue visible para BSA, en tanto se pudo distinguir en la ACF de TLL. Esto indicó que TLL tuvo una mayor afinidad que BSA para la superficie C18. El estudio demostró que TIR-FCS es una herramienta útil para cuantificar el efecto tensioactivo en la adsorción de proteínas. © 2007 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.


Rodriguez-Larrea, D., Ibarra-Molero, B., De Maria, L., Borchert, T.V., Sanchez-Ruiz, J.M.
“Beyond Lumry-Eyring: An unexpected pattern of operational reversibility/irreversibility in protein denaturation”
(Más allá de Lumry-Eyring: un patrón inesperado de reversibilidad/irreversibilidad operativa en la desnaturalización de las proteínas). Proteins: Structure, Function and Genetics, 70 (1), págs. 19-24. (2008)

Resumen

Hemos hallado que, contrario a lo que se cree comúnmente, el grado de reversibilidad operativa en la desnaturalización térmica de la lipasa de Thermomyces lanuginosa (una enzima industrial importante) en soluciones de urea alcanza el valor máximo cuando la proteína se calienta muchos grados por encima del final de la transición de desnaturalización inducida por temperatura. Al enfriarla a temperatura ambiente, la proteína parece alcanzar un estado con actividad enzimática similar a la del estado nativo inicial, pero con una mayor temperatura de desnaturalización y un comportamiento radicalmente distinto en términos de susceptibilidad a la desnaturalización irreversible. Estos resultados muestran que los patrones de reversibilidad/irreversibilidad operativa en la desnaturalización de las proteínas pueden ser más complejos que la clasificación de dos situaciones que se dan por sentadas (reversible frente a irreversible). Asimismo, coinciden con la posibilidad de que existan diferentes estados nativos o estados similares al nativo separados por altas barreras cinéticas en condiciones nativas, y sugieren procedimientos experimentales para alcanzar y estudiar estos estados nativos “alternativos”. © 2007 Wiley-Liss, Inc.

 

Jauffred, L., Callisen, T.H., Oddershede, L.B.
“Visco-elastic membrane tethers extracted from Escherichia coli by optical tweezers”
(Anclajes de membranas viscoelásticas extraídos de Escherichia coli mediante pinzas ópticas). Biophysical Journal, 93 (11), págs. 4068-4075. (2007)

Resumen

Se crearon anclajes entre una bacteria viva Escherichia coli y un gránulo, conectando de forma no específica el gránulo a la membrana externa y extrayéndolo mediante pinzas ópticas. Al liberarse, el gránulo volvió a la bacteria, lo que demuestra la existencia de un anclaje elástico entre el gránulo y la bacteria. Estos anclajes pueden tener decenas de micrones de largo, muchas veces la longitud de la bacteria. Mediante el uso de mutantes que expresan diferentes partes de la estructura de la membrana externa, hemos demostrado que se necesita un lipopolisacárido con núcleo intacto para la formación del anclaje, independientemente de si los gránulos no están cubiertos con poliestireno o si los gránulos tienen un recubrimiento de lectina. Se ha realizado una caracterización física de los anclajes que dio como resultado las siguientes relaciones entre fuerza y extensión del anclaje viscoelástico: para los primeros anclajes de tracción, la constante elástica de 10-12 pN/μm describe la viscoeslasticidad del anclaje; para las tracciones posteriores, la constancia elástica disminuye a 6-7 pN/μm, y se observan las típicas escalas de tiempo de relajación de cientos de segundos. Los estudios sobre la estabilidad de los anclajes en presencia de proteinasas, lipasas y amilasas nos permitieron sugerir que el anclaje extraído está compuesto principalmente por el lipopolisacárido asimétrico que contiene una bicapa de la membrana externa. Este mecanismo de conexión anclada no específica podría ser importante para el comienzo de la adhesión bacteriana. © 2007 de Biophysical Society.


Bagger, H.L., Øgendal, L.H., Westh, P.
“Solute effects on the irreversible aggregation of serum albumin”
(Efectos del soluto en la agregación irreversible de albúmina sérica) Biophysical Chemistry, 130 (1-2), págs. 17-25. (2007)

Resumen

El estrés térmico en la albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, BSA) promueve la agregación de proteínas a través de la formación de láminas beta intermoleculares. Hemos utilizado la dispersión de luz y cromatografía para estudiar los efectos de (<1 M) Na2SO4, NaSCN, sacarosa, sorbitol y urea en la tasa de agregación térmica. Ambas sales fueron inhibidores fuertes de la agregación de BSA y redujeron tanto el tamaño como la cantidad (concentración) de las partículas agregadas, en comparación con los solutos no iónicos (o amortiguador puro). Por lo tanto, las sales parecen suprimir tanto la nucleación como la tasa de crecimiento. Los aditivos no electrolíticos redujeron la tasa de agregación inicial (en comparación con el amortiguador puro), pero no limitaron significativamente el grado de agregación en las muestras extinguidas después de la exposición al calor durante 27 min (40-50 % de agregación en todas las muestras). Sin embargo, los aditivos no electrolíticos modificaron el proceso de agregación ya que provocaron consistentemente aglomerados más pequeños pero más concentrados que el amortiguador puro. Los resultados se discuten en función de las teorías de unión y el estado de transición. En este contexto, la tasa del proceso de agregación está sujeta al equilibrio entre un estado térmicamente desnaturalizado (D) y el estado de transición D≠. Por lo tanto, el efecto de un soluto depende de sus interacciones preferentes con D y D≠, respectivamente. Los resultados actuales no muestran ninguna correlación entre las interacciones preferentes de los solutos con la BSA nativa y su efecto en la tasa de agregación. Esto sugiere que las interacciones no específicas tipo serie de Hofmeister, que escalan con el área de superficie accesible al solvente, tienen una importancia menor. Por el contrario, la supresión inducida por sales de la agregación podría depender de la modulación de fuerzas electrostáticas específicas en el estado D≠. © 2007 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.


Nordkvist, M., Nielsen, P.M., Villadsen, J.

“Oxidation of lactose to lactobionic acid by a Microdochium nivale carbohydrate oxidase: Kinetics and operational stability”
(Producción de ácido lactobiónico por oxidación de lactosa a través de una oxidasa glucídica de Microdochium nivale: cinética y estabilidad operativa). Biotechnology and Bioengineering, 97 (4), págs. 694-707. (2007)

Resumen

Se estudió la producción de ácido lactobiónico por oxidación de lactosa a través de una oxidasa glucídica de Microdochium nivale. El valor Km para la lactosa, el cual se obtuvo mediante un ensayo enzimático tradicional, fue 0,066 mM con pH de 6,4 y 38 °C. Se estudió el efecto del oxígeno en la velocidad enzimática de reacción y la estabilidad operativa de la enzima mediante reacciones con un pH y una temperatura constantes en un reactor de tanque agitado. Se incluyó catalasa en todas las reacciones con el fin de evitar la inhibición y desactivación de la oxidasa a través del peróxido de hidrógeno. Con un pH de 6,4 y 38 °C, el valor Km para el oxígeno fue 0,97 mM, en tanto la constante de tasa catalítica (kcat) fue 94 s-1. Asimismo, hallamos que la estabilidad operativa de la oxidasa dependió del tipo de base utilizada para la neutralización del ácido producido. Por lo tanto, cuando se utilizó 2 M de NaOH para la neutralización de un medio de reacción con un amortiguador de 50 mM de fosfato, se observó una desactivación significativa de la oxidasa. Además, hallamos que la oxidasa estuvo protegida de la desactivación gracias a la base con altas concentraciones de lactosa. Se propone un modelo simple para explicar los resultados obtenidos. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.


Bagger, H.L., Hoffmann, S.V., Fuglsang, C.C., Westh, P.
“Glycoprotein-surfactant interactions: A calorimetric and spectroscopic investigation of the phytase-SDS system”
(Interacciones entre glucoproteínas y tensioactivos: una investigación calorimétrica y espectroscópica del sistema fitasa-SDS). Biophysical Chemistry, 129 (2-3), págs. 251-258. (2007)

Resumen

Se investigaron las interacciones del laurilsulfato de sodio (sodium dodecyl sulfate, SDS) y dos variantes de glucosa de la enzima fitasa de Peniophora lycii. Una era una variante altamente glucosilada (Phy), en tanto la otra era una variante enzimáticamente desglucosilada (dgPhy). Se estudiaron los efectos a 24 °C de la titulación de SDS a Phy y dgPhy mediante calorimetría de titulación isotérmica (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) y espectroscopia de dicroísmo circular con radiación de sincrotrón (Synchrotron Radiation Circular Dichroism, SRCD). Se utilizaron las comparaciones de los resultados de ambas variantes para explicar las interrelaciones entre glicanos y tensioactivos. Los espectros de dicroísmo circular (CD) sugirieron que tanto el estado nativo como el estado desnaturalizado con SDS de las dos variantes eran mutuamente similares y, por lo tanto, que el proceso de desnaturalización fue estructuralmente equivalente para las dos variantes de glucosa. El estado desnaturalizado no estuvo desplegado totalmente y probablemente retuvo un contenido importante de estructura similar al estado nativo. Además, se halló que los glicanos provocaron solo un pequeño aumento en la resistencia a la desnaturalización inducida por SDS. La concentración de SDS requerida para desnaturalizar la mitad de las moléculas de las proteínas varió en menos de 1 mM para las dos variantes. La afinidad para SDS de ambas variantes fue inusualmente baja. La cantidad de SDS fijado (p/p) en diferentes etapas del isoterma de unión fue 3-10 veces más baja que la informada para las proteínas globulares que se investigaron anteriormente. El análisis de la afinidad relativa de los grupos de glicanos y péptidos sugirió que los carbohidratos unen una cantidad mucho menor de tensioactivo. En la saturación, los glicanos adsorbieron aproximadamente la mitad de SDS (en g/g) que el grupo de péptidos de Phy, y aproximadamente cinco veces menos que las proteínas promedio. © 2007 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.


Sonesson, A.W., Elofsson, U.M., Callisen, T.H., Brismar, H.
“Tracking single lipase molecules on a trimyristin substrate surface using quantum dots”
(Rastreo de moléculas de lipasa individuales en una superficie de sustrato de trimiristina utilizando puntos cuánticos). Langmuir, 23 (16), págs. 8352-8356. (2007)

Resumen

Se ha analizado la movilidad de las moléculas de lipasa individuales mediante el rastreo de moléculas individuales en una superficie de sustrato de trimiristina. Esto se logró conjugando las lipasas con puntos cuánticos y utilizando microscopía láser confocal para analizar las superficies de trimiristina tratadas con la técnica spin-coating. Se recolectaron las series de imágenes de las moléculas de lipasa individuales y se cuantificó el coeficiente de difusión analizando el desplazamiento cuadrático medio de las trayectorias calculadas. Durante las condiciones sin flujo, el coeficiente de difusión de la lipasa fue (8,0 ± 5,0) × 10-10 cm2/s. Las trayectorias tuvieron un aspecto tipo “cuentas de collar” y la molécula de lipasa estuvo restringida en ciertas regiones de la superficie y luego migró a otra región donde continuó la difusión restringida. Esto generó conglomerados en las trayectorias. Cuando se aplicó un flujo al sistema, aumentaron la distancia total y la longitud del paso promedio entre los conglomerados, pero no afectó la difusión restringida en las regiones conglomeradas. Esto se puede explicar a través de la lipasa que opera en dos modos distintos en la superficie. En las regiones conglomeradas, la lipasa probablemente se orienta con el sitio activo hacia la superficie e hidroliza el sustrato. Se propone entre estas regiones un proceso de difusión en el cual la lipasa está en contacto con la superficie pero se ve afectada por el flujo externo. © 2007 American Chemical Society.


Nordkvist, M., Nielsen, P.M., Villadsen, J.
“Oxidation of lactose to lactobionic acid by a Microdochium nivale carbohydrate oxidase: Kinetics and operational stability”
(Producción de ácido lactobiónico por oxidación de lactosa a través de una oxidasa glucídica de Microdochium nivale: cinética y estabilidad operativa). Biotechnology and Bioengineering, 97 (4), págs. 694-707. (2007)

Resumen

Se estudió la producción de ácido lactobiónico por oxidación de lactosa a través de una oxidasa glucídica de Microdochium nivale. El valor Km para la lactosa, el cual se obtuvo mediante un ensayo enzimático tradicional, fue 0,066 mM con pH de 6,4 y 38 °C. Se estudió el efecto del oxígeno en la velocidad enzimática de reacción y la estabilidad operativa de la enzima mediante reacciones con un pH y una temperatura constantes en un reactor de tanque agitado. Se incluyó catalasa en todas las reacciones con el fin de evitar la inhibición y desactivación de la oxidasa a través del peróxido de hidrógeno. Con un pH de 6,4 y 38 °C, el valor Km para el oxígeno fue 0,97 mM, en tanto la constante de tasa catalítica (kcat) fue 94 s-1. Asimismo, hallamos que la estabilidad operativa de la oxidasa dependió del tipo de base utilizada para la neutralización del ácido producido. Por lo tanto, cuando se utilizó 2 M de NaOH para la neutralización de un medio de reacción con un amortiguador de 50 mM de fosfato, se observó una desactivación significativa de la oxidasa. Además, hallamos que la oxidasa estuvo protegida de la desactivación gracias a la base con altas concentraciones de lactosa. Se propone un modelo simple para explicar los resultados obtenidos. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.


Faber, C., Hobley, T.J., Mollerup, J., Thomas, O.R.T., Kaasgaard, S.G.
“Study of the solubility of a modified bacillus licheniformis α-amylase around the isoelectric point”
(Estudio de solubilidad de una α-amilasa modificada de Bacillus licheniformis alrededor del punto isoeléctrico). Journal of Chemical and Engineering Data, 52 (3), págs. 707-713. (2007)

Resumen

Se ha estudiado a través de cristalización fraccionada la solubilidad de una α-amilasa recombinante modificada de Bacillus licheniformis (mBLA). Se eligió una preparación semipura con cinco isoformas con valores de pH(I) de 6 a 7,3 (promedio ponderado de 6,6). También contaba con pequeñas cantidades (<1 %) de impurezas de proteínas. Se estudió la solubilidad en el rango de pH de 6 a 8. La menor solubilidad sin sales añadidas fue 60 mg mL-1 con pH de 7. La adición de 0,1 mol L-1 de sales sódicas de nitrato, sulfato y tiocianato tuvo un efecto menor en la solubilidad. Sin embargo, la solubilidad se redujo significativamente al añadir 0,5 mol L-1 de sulfato de sodio en todos los valores de pH, y aumentó con 0,5 mol L-1 de tiocianato de sodio con pH de 7 y pH de 8. El efecto de los aniones en la solubilidad de la α-amilasa siguió la serie de Hofmeister, y se observaron muy pocas pruebas de inversión por debajo del punto isoeléctrico. Los cationes tuvieron muy poco efecto en la solubilidad. Se determinaron el signo y la magnitud del potencial ζ de α-amilasa con y sin 0,1 mol L-1 de sal. Cualitativamente, el potencial ζ predijo correctamente la influencia de las diferentes sales en la solubilidad de mBLA. © 2007 American Chemical Society.


Nielsen, A.D., Borch, K., Westh, P.
“Thermal stability of Humicola insolens cutinase in aqueous SDS”
(Estabilidad térmica de la cutinasa de Humicola insolens en SDS acuoso). Journal of Physical Chemistry B, 111 (11), págs. 2941-2947. (2007)

Resumen

Se ha demostrado anteriormente que la cutinasa de Humicola insolens (HiC) une de forma anómala bajas cantidades del tensioactivo aniónico laurilsulfato de sodio (sodium dodecylsulfate, SDS). En el presente trabajo, hemos aplicado calorimetría de barrido y titulación para investigar las posibles relaciones entre esta interacción débil y el efecto de SDS en el equilibrio y la estabilidad cinética de HiC. Los resultados se presentan en un “diagrama de estado”, que especifica la forma estable de la proteína como una función de temperatura y concentración de SDS. En comparación con otras proteínas, SDS reduce significativamente la estabilidad de equilibrio de HiC. Para las concentraciones bajas de SDS (relación molar SDS:HiC, MR <8), este rasgo también se encuentra en la agregación térmica cinéticamente controlada de la proteína. Sin embargo, con una MR mayor, el SDS se estabiliza notablemente en comparación con la agregación irreversible. Se sugiere que esto depende de la repulsión electrostática de los complejos de HiC-SDS que posee cargas negativas en aumento. La interpretación combinada de los datos calorimétricos y de fijación permitieron calcular los cambios de la capacidad entálpica y de calentamiento para la asociación de HiC y SDS cerca del punto de saturación. La última función fue aproximadamente -410 J mol-1 K-1 o similar al cambio en la capacidad de calentamiento para la formación de la micela (-470 J mol-1 K-1). Esto sugiere que SDS se hidrata de manera similar en la forma micelar y la forma asociada con la proteína. Los resultados se discuten en términos de la teoría de Wyman de los equilibrios de ligamiento. El análisis cuantitativo en esta línea sugiere que el despliegue térmico reversible de la proteína se acopla con la unión de 2-3 moléculas adicionales de SDS. Esto corresponde a un aumento de 15-20 % en el número de unión. La teoría de Wyman también racionaliza las relaciones entre la afinidad baja y la susceptibilidad alta que se observaron en este estudio. © 2007 American Chemical Society.


Bertram, H.C., Kristensen, M., Østdal, H., Baron, C.P., Young, J.F., Andersen, H.J.
“Does oxidation affect the water functionality of myofibrillar proteins?”
(¿La oxidación afecta la funcionalidad del agua de las proteínas miofibrilares?). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55 (6), págs. 2342-2348. (2007)

Resumen

Se caracterizaron las propiedades de fijación del agua de las miofibrillas extraídas de músculo porcino, y hemoglobina añadida con y sin exposición a H2O2 utilizando relaxometría T2 magnética nuclear de campo bajo de protones. Se investigaron los efectos del pH y la fuerza iónica en las muestras con un ajuste del pH de 5,4; 6,2 y 7,0, y un ajuste de la fuerza iónica de 0,29; 0,46 y 0,71 M, respectivamente. La formación de ditirosina como una medida de entrecruzamiento oxidativo de las proteínas reveló un aumento importante en las concentraciones de ditirosina con la activación de H2O2. La formación de ditirosina dependió en gran medida del pH y aumentó con un pH menor. Además, se observaron mayores niveles de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico con la adición de H2O2, lo que sugiere que la oxidación lipídica fue mejor, pero con un patrón de oxidación diferente, en comparación con las proteínas miofibrilares. Las mediciones de relajación de RMN de campo bajo relevaron menores tiempos de relajación T2 con la activación de H2O2, lo que corresponde a una menor capacidad de conservación del agua con la oxidación. Sin embargo, no se observó una relación directa entre el grado de oxidación y el tiempo de relajación T2 con diversos valores de pH y fuerzas iónicas; por lo tanto, se necesitan más estudios para comprender íntegramente el efecto de la oxidación en la funcionalidad miofibrilar. © 2007 American Chemical Society.


Sonesson, A.W., Brismar, H., Callisen, T.H., Elofsson, U.M.
“Mobility of Thermomyces lanuginosus lipase on a trimyristin substrate surface”
(Movilidad de la lipasa de Thermomyces lanuginosus en una superficie de sustrato de trimiristina). Langmuir, 23 (5), págs. 2706-2713. (2007)

Resumen

Hemos estudiado la movilidad de la lipasa activa e inactiva de Thermomyces lanuginosus (TLL) en una superficie de sustrato de trimiristina (tratada con la técnica spin-coating) utilizando la recuperación de fluorescencia posterior al fotoblanqueamiento (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP) en un sistema de microscopía confocal. Mediante el fotoblanqueamiento de un punto circular de TLL marcada con fluorescencia en una superficie de trimiristina lisa, fue posible cuantificar tanto el coeficiente de difusión D como la fracción móvil f. Se utilizó la técnica FRAP en las superficies con diferente densidad superficial de la lipasa y como una función del tiempo tras la adsorción. Los datos mostraron que la movilidad de TLL fue significativamente mayor en las superficies de sustrato de trimiristina, en comparación con nuestros estudios anteriores sobre las superficies modelo hidrofóbicas. Para ambas variantes de lipasa, la difusión disminuyó a tasas similares con una alta densidad superficial relativa de la lipasa, lo que sugiere que los efectos de hacinamiento son dominantes con una mayor cantidad adsorbida de lipasa. Sin embargo, el coeficiente de difusión a dilución de superficie infinita extrapolada (D0) fue mayor para la TLL activa, en comparación con la TLL inactiva (D0 = 17,9 × 10-11 cm2/s en comparación con D0 = 4,1 × 10-11 cm2/s [datos para el primer intervalo de tiempo después de la adsorción]). Asimismo, la difusión disminuyó con el tiempo tras la adsorción, lo que fue más evidente para la TLL activa. Los resultados se explican a través de la inhibición del producto, es decir, que la acumulación de productos de ácidos grasos con carga negativa disminuyó la tasa de difusión de las lipasas activas con el tiempo. Esto se respalda mediante experimentos de adsorción secuenciales en los que se estudió la cantidad adsorbida en condiciones de flujo como una función del tiempo tras la adsorción. Una segunda inyección de lipasa causó un aumento significativamente menor en la cantidad adsorbida cuando la superficie de trimiristina se trató previamente con TLL activa, en comparación con el tratamiento previo con TLL inactiva. © 2007 American Chemical Society.


Xu, F., Ding, H. 
“A new kinetic model for heterogeneous (or spatially confined) enzymatic catalysis: Contributions from the fractal and jamming (overcrowding) effects”
(Un nuevo modelo cinético para la catálisis enzimática heterogénea [o en espacios confinados]: contribuciones de los efectos fractales y de “atasco” [hacinamiento]). Applied Catalysis A: General, 317 (1), págs. 70-81. (2007)

Resumen

En la catálisis heterogénea, los catalizadores y reactantes están separados en fases diferentes. En estos sistemas, la interacción entre el reactante y el catalizador puede ser diferente de su contraparte homogénea debido a la peculiaridad de los procesos de difusión y colisión molecular confinados en espacios con dimensión menor a tres. La teoría fractal, desarrollada para los procesos matemáticos, físicos, químicos y biológicos que poseen una irregularidad y complejidad inherentes, se puede aplicar a la catálisis heterogénea. Para entender mejor las reacciones enzimáticas heterogéneas, se reformuló la cinética de Michaelis fractal después de aplicar el formalismo fractal general al modelo clásico de reacciones enzimáticas homogéneas. También se estudió el efecto cinético de “atasco” causado por el hacinamiento de la enzima/sustrato en un espacio confinado. El nuevo modelo cinético se aplicó a la hidrólisis de celulosa a través de celobiohidrolasa, un sistema biocatalítico heterogéneo representativo altamente fractal debido a la fuerte adsorción de superficie de la enzima en el sustrato insoluble y el mecanismo enzimático “procesivo” unidimensional. Se discutió la utilidad del modelo para el estudio y la aplicación de otras reacciones enzimáticas. © 2006 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.


Balashev, K., John DiNardo, N., Callisen, T.H., Svendsen, A., Bjørnholm, T.
“Atomic force microscope visualization of lipid bilayer degradation due to action of phospholipase A2 and Humicola lanuginosa lipase”
(Visualización con microscopio de fuerza atómica de la degradación de la bicapa lipídica debido a la acción de la fosfolipasa A2 y la lipasa de Humicola lanuginosa). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, 1768 (1), págs. 90-99. (2007)

Resumen

La importante aplicación de microscopía de fuerza atómica (Atomic Force Microscopy, AFM) en celda líquida es el estudio de la estructura y el comportamiento de las enzimas en medios moleculares organizados que imitan los sistemas in vivo. En este estudio demostramos el uso de AFM como una herramienta para estudiar la cinética de las reacciones de las enzimas lipolíticas que ocurren en la superficie de una bicapa lipídica. En particular, se ha estudiado el curso cronológico de la degradación de las bicapas lipídicas mediante la fosfolipasa A2 (PLA2) y la lipasa de Humicola Lanuginosa (HLL). El análisis por imágenes en modo contacto permite visualizar la actividad enzimática en el sustrato con resolución lateral alta. Las bicapas lipídicas se prepararon mediante la técnica de Langmuir-Blodgett y se transfirieron a una celda líquida de AFM. Después de la inyección de la enzima en la celda líquida, se tomó una secuencia de imágenes a intervalos regulares para permitir la identificación de la estructura del sustrato, los puntos preferidos de activación enzimática y las tasas de reacción de la enzima. © 2006 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.


Seema, Kumari, R., Gupta, G., Saluja, D., Kumar, A., Goel, S., Tyagi, Y.K., Gulati, R., Vinocha, A., Muralidhar, K., Dwarakanth, B.S., Rastogi, R.C., Parmar, V.S., Patkar, S.A., Raj, H.G.
“Characterization of protein transacetylase from human placenta as a signaling molecule calreticulin using polyphenolic peracetates as the acetyl group donors”
(Caracterización de acetiltransferasa de placenta humana como una molécula señal de calreticulina utilizando peracetatos polifenólicos como donantes del grupo acetilo). Cell Biochemistry and Biophysics, 47 (1), págs. 53-64. (2007)

Resumen

Hemos demostrado anteriormente que una enzima única unida a la membrana interviene en la transferencia de los grupos acetilo desde los peracetatos polifenólicos (PA) a las proteínas funcionales, lo que se definió como acetiltransferasa fármaco-proteína acetoxi (TAase) porque actúa en numerosas clases de PA. En este estudio, se informa la purificación de TAase a partir de microsomas de placenta humana hasta obtener homogeneidad con una masa molecular de 60 kDa, lo que muestra diversos grados de especificidad con respecto a numerosas clases de PA, y se confirma la relación entre la estructura y la actividad para la TAase unida al microsoma. La acetilación de la proteína catalizada con TAase mediante un fármaco modelo de acetoxi, 7,8-diacetoxi-4-metil cumarina (DAMC), se estableció mediante la demostración de inmunoreactividad de la proteína diana acetilada con anticuerpo de lisina anti-acetilo. La actividad de TAase se inhibió seriamente en los microsomas con calcio agregado y cuando se añadió Ca2+ a la TAase purificada, lo que sugiere que TAase podría ser una proteína que fija el calcio. Asimismo, el análisis de la secuencia ligada al extremo aminoterminal de TAase purificada (EPAVYFKEQFLD) utilizando la base de datos Swiss Prot dio como resultado una coincidencia perfecta con calreticulina (CRT), una importante proteína microsomática que fija el calcio y se encuentra en el retículo endoplásmico (endoplasmic reticulum, ER). La identidad de TAase con CRT se verificó al observar que la TAase purificada reaccionó de forma ávida cuando se produjo el anticuerpo comercial contra el extremo C-terminal de CRT humana (péptido de 13 residuos, DEEDATGQAKDEL). La TAase purificada también mostró fijación de Ca2+ y actuó como sustrato para la fosforilación catalizada por la proteína quinasa C (protein kinase C, PKC), los cuales son características distintivas de CRT. Asimismo, la CRT purificada de placenta y la CRT pura comercial dieron como resultado una actividad catalítica significativa de TAase y también fueron efectivas en la mediación de la acetilación de la proteína NADPH-citocromo P-450 reductasa mediante DAMC, según se detectó mediante Western blot utilizando el anticuerpo de lisina anti-acetilo. Estas observaciones atribuyen por primera vez de manera convincente la función de acetiltransferasa a CRT. Por lo tanto, esta función de la acetiltransferasa de CRT se denomina acetiltransferasa de calreticulina (CRTAase). Creemos que CRTAase desempeña una función importante en la modificación de las proteínas por medio de la acetilación independiente de la coenzima A. © Copyright 2007 de Humana Press Inc. Reservados todos los derechos de cualquier tipo.


Rathore, N., Gellman, S.H., De Pablo, J.J.
“Thermodynamic stability of β-peptide helices and the role of cyclic residues”
(Estabilidad termodinámica de las hélices del péptido beta y el rol de los residuos cíclicos). Biophysical Journal, 91 (9), págs. 3425-3435. (2006)

Resumen

Los péptidos beta están emergiendo como una clase atractiva de moléculas peptidomiméticas. En contraste con los péptidos alfa naturales, los oligómeros cortos de los aminoácidos beta (que contienen solo 4-6 monómeros) muestran estructuras secundarias estables que los hacen flexibles para estudios cuantitativos, experimentales concertados y teóricos de los efectos de las interacciones químicas particulares en la estructura. En este trabajo se utilizan simulaciones moleculares para estudiar la estabilidad termodinámica de las conformaciones helicoidales formadas por los péptidos beta que contienen diferentes proporciones de residuos acíclicos (β3) y cíclicos (ACH). De forma más específica, en este trabajo se consideran muchos péptidos beta que difieren solo en su contenido de residuos cíclicos. Los estudios computacionales anteriores de los péptidos beta han utilizado en su mayor parte la minimización de energía en las simulaciones de dinámica molecular. Por el contrario, nuestro estudio utiliza simulaciones de Monte Carlo basadas en la densidad de los estados para calcular la energía libre y evaluar la estabilidad de diversas estructuras plegadas de estas moléculas junto con un parámetro de orden bien definido. Mediante el uso de un formalismo de conjunto expandido, podemos determinar la energía libre requerida para desplegar moléculas específicas, una cantidad que podría medirse directamente a través de espectroscopia de fuerza sobre moléculas individuales. Las simulaciones en solventes implícitos y explícitos han permitido un estudio sistemático de la función de los residuos cíclicos y la electrostática en la estabilidad de las estructuras secundarias. Se sabe que las moléculas consideradas en este trabajo exhiben conformaciones helicoidales H-14 estables y, en algunos casos, conformaciones H-12 relativamente estables, lo que sugiere que la calidad del solvente se puede utilizar para manipular los patrones de unión de hidrógeno y la estructura de estos péptidos. © 2006 de Biophysical Society.


Ransbarger, D., Xu, F.
“Activation of laccase by penicillin and derivatives”
(Activación de lacasa mediante penicilina y derivados). Process Biochemistry, 41 (9), págs. 2082-2086. (2006)

Resumen

La lacasa es capaz de oxidar una amplia variedad de sustancias reductoras y posee un potencial enorme para diversas aplicaciones biocatalíticas. Se están realizando trabajos exhaustivos de investigación con el fin de mejorar la actividad, especificidad y estabilidad de la lacasa. Observamos que la preincubación con penicilina provocó una activación significativa de una lacasa de Rhizoctonia solani, aunque la penicilina no fue un sustrato de reducción-oxidación de la enzima. La activación afectó principalmente la kcat de la lacasa, y el efecto fue óptimo con un pH de 5. La ampicilina y el ácido peniciloico también fueron activos en la lacasa (aunque su efecto fue más débil que el de la penicilina), pero el ácido 6-aminopenicilánico, el ácido fenilacético y la cefalexina no fueron activos. El efecto aparente de la penicilina se atribuyó a una interacción de reducción-oxidación con el esqueleto polipeptídico de la lacasa. El efecto fue significativamente más débil en las lacasas de Myceliophthora thermophila y Trametes villosa. © 2006 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.


Rodriguez-Larrea, D., Minning, S., Borchert, T.V., Sanchez-Ruiz, J.M.
“Role of Solvation Barriers in Protein Kinetic Stability”
(La función de las barreras de solvatación en la estabilidad cinética de las proteínas). Journal of Molecular Biology, 360 (3), págs. 715-724. (2006)

Resumen

La estabilidad de muchos sistemas de proteínas de interés ha demostrado tener una base cinética. Además de las implicaciones biotecnológicas evidentes, el interés general de entender la estabilidad cinética de las proteínas se acentúa debido a que algunos métodos moleculares emergentes para la inhibición de la amiloidogénesis se enfocan en el aumento de la estabilidad cinética de los estados nativos de las proteínas. Las lipasas se encuentran dentro de las enzimas industriales más importantes. En este trabajo hemos estudiado la desnaturalización térmica de la forma natural, cuatro variantes de mutante individual y dos variantes de múltiples mutantes altamente estables de la lipasa de Thermomyces lanuginosa. En todos los casos, la desnaturalización térmica fue irreversible, se controló cinéticamente y se conformó según el modelo irreversible de dos estados. Este resultado respalda la idea de que el novedoso método de evolución dirigida enfocado en la dinámica molecular que se utiliza en la preparación de variantes altamente estables es satisfactorio, probablemente porque aborda la estabilidad cinética y, en particular, porque las simulaciones de dinámica molecular con calor posiblemente identifican las regiones de las interacciones nativas alteradas en el estado de transición para la desnaturalización irreversible. Asimismo, hallamos efectos de mutación muy importantes en la entalpía y entropía de activación que no estuvieron acompañados de cambios importantes similares en el valor-m de cinética de la urea. Por consiguiente, podemos concluir que estos efectos de mutación están asociados con alguna característica estructural del estado de transición para el proceso de desnaturalización irreversible que no está ligada a los cambios importantes en la accesibilidad del solvente. Los estudios computacionales recientes han sugerido la existencia de barreras de solvatación/desolvatación en al menos algunos procesos de plegamiento/despliegue de proteínas. Por lo tanto, proponemos que una barrera de solvatación (que ocurra a raíz de la asincronía entre la ruptura de contactos internos y la penetración de agua) puede contribuir a la estabilidad cinética de la lipasa de T. lanuginosa (y, posiblemente, también a la estabilidad cinética de otras proteínas). © 2006 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.


Sonesson, A.W., Elofsson, U.M., Brismar, H., Callisen, T.H.
“Adsorption and mobility of a lipase at a hydrophobic surface in the presence of surfactants”
(Adsorción y movilidad de una lipasa en una superficie hidrofóbica en presencia de tensioactivos). Langmuir, 22 (13), págs. 5810-5817. (2006)

Resumen

Con el objetivo de poder manipular los procesos utilizados en la catálisis interfacial, hemos estudiado los efectos de una mezcla de tensioactivos no iónicos/aniónicos, C12E1/LAS (1:2 mol %) en la adsorción y movilidad de superficie de una lipasa obtenida de Thermomyces lanuginosus (TLL). Se utilizaron la resonancia de plasmones superficiales (surface plasmon resonance, SPR) y elipsometría para analizar el proceso de adsorción competitivo entre los tensioactivos y TLL en las superficies modelo hidrofóbicas que pretendían imitar un sustrato aceitoso para la lipasa. Obtuvimos el coeficiente de difusión de superficie de una variante de TLL marcada con fluorescencia en sílice silanizada con octadeciltriclorosilano (OTS) utilizando la recuperación de fluorescencia posterior al fotoblanqueamiento (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP) en un microscopio láser confocal. Por medio de elipsometría, calibramos la intensidad de la fluorescencia con la densidad de superficie de la lipasa. Se midió la difusión de TLL en diferentes densidades de superficie de la enzima y en dos intervalos de tiempo tras la coabsorción con diferentes concentraciones de C12E6/LAS. Las concentraciones de los tensioactivos se eligieron para representar las concentraciones inferiores a la concentración micelar crítica (critical micelle concentration, CMC), las concentraciones en la región de CMC, y las concentraciones superiores a CMC. La difusión de superficie de TLL aparente se extrapoló a dilución de superficie infinita (D0). Hallamos que la presencia de tensioactivos moduló fuertemente la movilidad de superficie de TLL: con D0 = 0,8 × 10-11 cm2/s sin tensioactivos, y D0 = 13,1 × 10-11 cm2/s con tensioactivos superiores a la CMC. El aumento en la movilidad de la lipasa al pasar la CMC también estuvo acompañado de un aumento de dos veces la fracción móvil de TLL. Los análisis de SPR revelaron que C12E6/LAS desplazó a la TLL unida a la superficie de una manera que dependió de la concentración, lo que sugiere que el aumento observado en la movilidad de superficie imparte la difusión mediada por volumen y la denominada reunión de TLL con la superficie. Nuestros resultados combinados sobre la adsorción competitiva de la lipasa y los tensioactivos y la movilidad de superficie de la lipasa muestran cómo los tensioactivos pueden desempeñar una función importante en la regulación de la catálisis interfacial, lo que abarca desde la digestión fisiológica hasta las aplicaciones técnicas, como la detergencia. © 2006 American Chemical Society.


Raj, H.G., Kumari, R., Seema, Gupta, G., Kumar, R., Saluja, D., Muralidhar, K.M., Kumar, A., Dwarkanath, B.S., Rastogi, R.C., Prasad, A.K., Patkar, S.A., Watterson, A.C., Parmar, V.S.
“Novel function of calreticulin: Characterization of calreticulin as a transacetylase-mediating protein acetylator independent of acetyl CoA using polyphenolic acetates”
(Una función novedosa de la calreticulina: caracterización de la calreticulina como acetilador de la proteína mediadora de acetiltransferasa independiente de la coenzima A utilizando acetatos polifenólicos). Pure and Applied Chemistry, 78 (5), págs. 985-992. (2006).

Resumen

Nuestras investigaciones anteriores culminaron con el descubrimiento de una enzima única ligada a la membrana en células de mamíferos que catalizan la transferencia del grupo acetilo desde acetatos polifenólicos (polyphenolic acetates, PA) a ciertas proteínas funcionales, lo que provoca la modulación de sus actividades. Esta enzima se denominó acetiltransferasa fármaco-proteína acetoxi (TAase) porque actúa en numerosas clases de PA. TAase se purificó a partir de microsomas hepáticos de rata hasta obtener homogeneidad, y mostró un peso molecular de 55 KDa. La acetilación de la proteína catalizada con TAase a través de los PA se demostró mediante la inmunoreactividad de la proteína diana acetilada, como la sintasa de óxido nítrico (nitric oxide synthase, NOS) con lisina anti-acetilo. La posible acetilación de NOS de plaquetas humanas mediante PA como se describe anteriormente provocó una mejora en los niveles intracelulares de óxido nítrico (NO). A diferencia de los polifenoles primarios, se halló que los PA mostraron efectos fisiológicos relacionados con el NO. Se descubrió que la secuencia ligada al extremo aminoterminal mostró una homología del 100 % con la secuencia ligada al extremo aminoterminal de la calreticulina (CRT) madura. Se evidenció la identificación de TAasa con CRT, una proteína del retículo endoplásmico (endoplasmic reticulum, ER), por demostración de las propiedades de CRT, como inmunorreactividad con anti-calrreticulina, unión a iones de Ca2+ y actuar como sustrato para la fosforilación por parte de la proteína-cinasa C (protein kinase C, PKC), que son las características distintivas de la CRT. Por primera vez, estas observaciones atribuyen, de manera convincente, la función de la acetiltransferasa a la CRT, que posiblemente tiene una función importante en la modificación de las proteínas al llevar a cabo la acetilación de diversas enzimas por medio de un mecanismo bioquímico independiente de la acetil coenzima A. © 2006 IUPAC.


Høiberg-Nielsen, R., Fuglsang, C.C., Arleth, L., Westh, P.
“Interrelationships of glycosylation and aggregation kinetics for Peniophora lycii phytase”
(Interrelaciones de la glucosilación y la cinética de agregación de la fitasa de Peniophora lycii phytase) Biochemistry, 45 (15), pp. 5057-5066. (2006)

Resumen

Se estudió la cinética de la agregación térmica de la glucoproteína fitasa de Peniophora lycii (Phy) y de la forma desglucosilada (dgPhy) por dispersión dinámica de luz (dynamic light scattering, DLS) y por dispersión estática de luz (static light scattering, SLS). Se obtuvo una descripción detallada del tiempo de formación de agregados pequeños (∼10-100 moléculas) de la enzima. También se investigó la estabilidad termodinámica de ambas formas por calorimetría diferencial de barrido (differential scanning calorimetry, DSC). Se observó que los glucanos fomentaban potentemente la estabilidad cinética (es decir, reducían la tasa de desnaturalización irreversible) y, al mismo tiempo, no alteraban, en gran medida, el equilibrio de la temperatura de la desnaturalización, Td, definida por la DSC. Por ejemplo, con un pH de 4,5-5,0, la dgPhy se agregó ∼200 veces más rápido que la Phy, incluso la diferencia en la Td fue solo de 1-3 °C. Para elucidar el mecanismo por el cual los glucanos fomentan la estabilidad cinética, se midió el efecto de la fuerza iónica y de la temperatura sobre la tasa de agregación. Además, se midieron los segundos coeficientes viriales (B22) de ambas formas por SLS. Según estos resultados, la tasa de agregación de Phy aumentó con la concentración de la proteína térmicamente desnaturalizada. Esto indicó una cinética de primer orden en comparación con la concentración del estado térmicamente desnaturalizado. Se observó una correlación similar, aunque menos pronunciada, con la dgPhy, y se indicó que, si bien el proceso de agregación de la forma desglucosilada está dominada por la proteína desnaturalizada, también implica una contribución menor de las moléculas de asociación en estado natural. Las mediciones de los B22 reveló que la dgPhy presenta valores levemente mayores que la Phy. Esto indica que la dgPhy interactúa más favorablemente con el amortiguador que la Phy y, por lo tanto, se descarta una hidratación potente de los glucanos como el origen de su efecto sobre la estabilidad cinética. Sobre la base de esto y de los efectos del pH y la fuerza iónica, se sugiere que la inhibición de la agregación más probablemente dependa del impedimento estérico de los glucanos en la forma agregada de la proteína. © 2006 American Chemical Society.


Bagger, H.L., Fuglsang, C.C., Westh, P.
“Hydration of a glycoprotein: Relative water affinity of peptide and glycan moieties”
(Hidratación de una glucoproteína: afinidad relativa por el agua de los grupos de péptidos y glucanos) European Biophysics Journal, 35 (4), pp. 367-371. (2006)

Resumen

La glucosilación, la modificación postraduccional de proteínas más prevalente, afecta diversas propiedades físicas, incluso las interacciones con el disolvente acuoso circundante. Se analizaron estas interacciones entre los glucanos y el agua en relación con el aumento de la solubilidad que se observa, en general, con las glucoproteínas, aunque el respaldo experimental de esta correlación sigue siendo escaso. Se aplicó un método de calorimetría de dos canales para medir la energía libre y la entalpía y entropía de la hidratación a 25 °C de la glucoproteína fitasa (Phy) y la forma desglucosilada (dgPhy) de la misma proteína. Las comparaciones de los resultados obtenidos con la Phy y la dgPhy indican que el grupo de polipéptidos tiene una mayor afinidad por el agua que los glucanos. De hecho, con niveles de hidratación leves (∼0,3 g de agua/g de macromolécula), la captación de agua parece estar completamente gobernada por la adsorción a los grupos de péptidos. A modo de conclusión, es poco probable que la interacción potenciada con el disolvente sea el mecanismo subyacente del aumento de la solubilidad y la disminución de la propensión de la agregación que suelen informarse como resultado de la glucosilación de las proteínas. © EBSA 2005.


Hedin, E.M.K., Høyrup, P., Patkar, S.A., Vind, J., Svendsen, A., Hult, K.
“Implications of surface charge and curvature for the binding orientation of Thermomyces lanuginosus lipase on negatively charged or zwitterionic phospholipid vesicles as studied by ESR spectroscopy”
(Implicancias de la carga de superficie y la curvatura para la orientación de la unión de la lipasa de Thermomyces lanuginosus sobre las vesículas de fosfolípidos de carga negativa o zwitteriónicas por espectroscopía de resonancia de espín electrónico) Biochemistry, 44 (50), pp. 16658-16671. (2005)

Resumen

La triglicérido lipasa (EC 3.1.1.3) de Thermomyces lanuginosus (Thermomyces lanuginosus lipase, TLL) se une con alta afinidad a las vesículas unilamelares de fosfolípidos que sirven como interfaz de disolución de la lipasa y del sustrato, pero exhibe activación interfacial solamente en las vesículas pequeñas y con carga negativa [Cajal, Y. y col. (2000) Biochemistry 39, 413-423]. Se determinó previamente la orientación de la unión en modo productivo de la TLL en la interfaz lípido-agua de las vesículas unilamelares pequeñas (small unilamellar vesicles, SUV), que constan de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol (POPG), por espectroscopía de resonancia de espín electrónico (electron spin resonance, ESR) en combinación con rotulado del espín dirigido al sitio [Hedin, E. M. K. y col. (2002) Biochemistry 41, 14185-14196]. En nuestra investigación, se estudió la orientación interfacial de la TLL unida a vesículas unilamelares grandes (large unilamellar vesicles, LUV), que constaban de POPG, y unida a SUV, que constaban de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (POPC). Se rotularon 11 mutantes de TLL con una sola cisteína como descritos con anterioridad, y se estudiaron tras la unión a la membrana con un agente de relajación del espín hidrosoluble, oxalato de cromo(III) (Crox). Además, las vesículas rotuladas con dansilo revelaron la eficacia de la extinción por fluorescencia intermolecular entre cada rótulo de espín colocado en la TLL y la membrana lipídica. Los datos de la exposición a la ESR y de la extinción por fluorescencia indican que la TLL se asocia más a la superficie del PG con carga negativa que a la superficie de la PC zwitteriónica y se une a las LUV con POPG y a las SUV con POPC predominantemente por la parte cóncava posterior de la TLL frente al sitio activo, como se observa por los residuos de contacto K74C-SL, R209C-SL y T192C-SL. Esta orientación es significativamente diferente en comparación con la de las SUV con POPG y podría explicar las diferencias en la activación de la lipasa. Evidentemente, tanto la carga como la accesibilidad (curvatura) de la superficie de las vesículas determinan la orientación de la TLL en la interfaz fosfolipídica. © 2005 American Chemical Society.


Sonesson, A.W., Callisen, T.H., Brismar, H., Elofsson, U.M.
“Lipase surface diffusion studied by fluorescence recovery after photobleaching”
(Difusión de la superficie de la lipasa estudiada por recuperación de fluorescencia tras un fotoblanqueo) Langmuir, 21 (25), pp. 11949-11956. (2005)

Resumen

Se analizaron las propiedades de difusión de la superficie de una variante de lipasa de Thermomyces lanuginosa (Thermomyces lanuginosa lipase, TLL) en sílice hidrofílico y en sílice metilado con diclorodimetilsilano (DDS) u octadeciltriclorosilano (OTS). Para este estudio, se desarrolló un método novedoso de análisis de difusión en superficies sólidas. El método se basa en la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo con microscopía confocal. Cuando se fotoblanqueó un área rectangular de la muestra, fue posible analizar la recuperación de fluorescencia como una difusión monodimensional, lo que generó expresiones matemáticas simplificadas para ajustar los datos. Inicialmente se evaluó el método por medición de la difusión de seroalbúmina bovina en vidrio, lo que generó un coeficiente de difusión que se correspondía adecuadamente con los informes anteriores. Para el análisis de la difusión de la TLL, se usaron datos de elipsometría de la adsorción de TLL para calibrar la intensidad de la fluorescencia con la densidad de superficie de la lipasa, lo que permitió obtener mediciones del coeficiente de difusión con densidades de superficie diferentes. El coeficiente de difusión promedio se calculó en dos momentos después de la adsorción. La fracción móvil y el coeficiente de difusión fueron los más bajos en la superficie con OTS cuando se extrapolaron los datos a una dilución de superficie infinita. Asimismo, la tasa de difusión disminuyó con el tiempo en las superficies hidrofóbicas. Nuestras observaciones pueden explicarse por el hecho de que la superficie depende de la distribución de las orientaciones y las conformaciones de la TLL adsorbida, donde la transición de una estructura cerrada a una estructura abierta, catalíticamente activa y más hidrofóbica es importante. © 2005 American Chemical Society.


Rønne, T.H., Pedersen, L.S., Xu, E.
“Triglycéride selectivity of immobilized thermomyces lanuginosa lipase in interesterification”
(Selectividad de los triglicéridos por la lipasa de Thermomyces lanuginosa en la interesterificación) JAOCS, Journal of the American Oil Chemists' Society, 82 (10), pp. 737-743. (2005)

Resumen

Se investigó la selectividad de los triglicéridos (ácidos grasos [fatty acids, FA]) de una lipasa de Thermomyces lanuginosa inmovilizada (Lipozyme TL IM) en reacciones de interesterificación catalizadas con lipasa entre dos TG monoácidos en n-hexano. Se usó triestearina (tri-C18:0) como referencia en una serie de TG con FA saturados de tri-C4:0 a tri-C20:0, excepto tri-C6:0, y en una serie de FA insaturados de tri-C18:1 a tri-C18:3. La cuantificación se realizó por HPLC y se usaron varios métodos para evaluar la selectividad. Ninguno de los métodos utilizados mostró diferencias significativas entre los rendimientos de la lipasa en los diferentes TG, lo que indica que Lipozyme TL IM no es selectiva de los FA ni de los TG en el sistema empleado. Se usó un diseño de superficie de respuesta para investigar la influencia de las actividades del agua (water activities, aw) y las temperaturas de reacción sobre la reactividad de Lipozyme TL IM con un sistema de tripalmitina (tri-C16:0) y trilaurina (tri-C12:0) en n-hexano. Se observó que un aumento de la temperatura (de 40 °C a 60 °C) afectaba la reactividad de la lipasa de manera significativa. La reactividad de Lipozyme TL IM no se vio afectada por el cambio en la aw de 0,1130 a 0,5289. Un aumento de la aw produjo solamente un incremento en la formación de ácidos grasos libres. Copyright © 2005 de AOCS Press.


Nielsen, A.D., Arleth, L., Westh, P.
“Analysis of protein-surfactant interactions - A titration calorimetric and fluorescence spectroscopic investigation of interactions between Humicola insolens cutinase and an anionic surfactant”
(Análisis de las interacciones entre proteínas y surfactantes: investigación espectroscópica por fluorescencia y titulación calorimétrica de las interacciones entre la cutinasa de Humicola insolens y un surfactante aniónico) Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1752 (2), pp. 124-132. (2005)

Resumen

Se estudiaron las interacciones de la cutinasa de Humicula insolens (cutinase from Humicula insolens, HiC) y el dodecilsulfato sódico (sodium dodecyl sulphate, SDS) por calorimetría y fluorescencia en paralelo en los sistemas en los que las concentraciones de ambos componentes se modificaron sistemáticamente. Los resultados obtenidos con ambos métodos muestran diversas características simultáneas al graficarlos en función de la concentración total de SDS, [SDS]tot. Se asignó el origen molecular de varias de estas anomalías y se identificaron cinco intervalos de la [SDS]tot en los cuales predominaron diferentes modos de interacción. De la [SDS]tot menor a la mayor, estos modos se presentaron de la siguiente manera: unión de (poco) SDS a la HiC natural, formación de agregados proteínicos oligoméricos, desnaturalización de la HiC y adsorción de SDS en la proteína desnaturalizada. Para la [SDS]tot > 3-6 mM (según la concentración de la proteína), se saturó la adsorción y no fue posible detectar otras interacciones entre la proteína y el detergente. Se atribuyeron dos anomalías especialmente llamativas en los datos de la calorimetría a la desnaturalización y saturación, respectivamente. Se observó que la [SDS]tot en estos puntos dependía linealmente de la concentración (total) de la proteína, [HiC]. Se cree que esto refleja el equilibrio entre el SDS unido y el SDS libre [SDS]tot = [SDS] aq + [HiC] Nb, donde [SDS]aq y Nb son, respectivamente, la concentración acuosa (“libre”) del SDS y la cantidad promedio de SDS unido por proteína. La interpretación de los resultados en este sentido indicó que la HiC se desnaturaliza con una temperatura de 22 °C y un pH de 7,0. Rosgaard, L., Zygadlo, A., Scheller, H.V., Mant, A., Jensen, P.E.


“Insertion of the plant photosystem I subunit G into the thylakoid membrane: In vitro and in vivo studies of wild-type and tagged versions of the protein”
(Inserción de la subunidad G del fotosistema vegetal 1 en la membrana de los tilacoides: estudios in vitro e in vivo de las versiones natural y marcada de la proteína) FEBS Journal, 272 (15), pp. 4002-4010. (2005)

Resumen

La subunidad G del fotosistema 1 es una proteína codificada en el núcleo que previsiblemente forma dos hélices alfa transmembranarias separadas por una región bucle. Se usaron valoraciones de importación in vitro para demostrar que el dominio del bucle con carga positiva se enfrenta al estroma, mientras que los extremos N y C muy probablemente se enfrentan al lumen. Los constructos de la subunidad G del fotosistema 1 (photosystem I subunit G, PSI-G) en los cuales se colocó una marca de His o Strep en el extremo C o en la región del bucle se insertan con la misma topología que la PSI-G de tipo natural. Sin embargo, la presencia de marcas en el bucle hace que la proteína insertada en la membrana sea significativamente más sensible a la tripsina, al parecer debido a la interrupción de la inserción entre el bucle y el núcleo del PSI. Los vegetales inactivados que carecían de la PSI-G se transformaron con los constructos que codificaban proteínas marcadas del extremo C y del bucle de la PSI-G. Los experimentos con los tilacoides de las líneas transgénicas demuestran que las versiones marcadas en los extremos C de la PSI-G adoptan la misma topología que la PSI-G de tipo natural, mientras que las versiones marcadas en el bucle afectan la sensibilidad de la región del bucle a la tripsina, lo que confirma las observaciones hechas in vitro. Además, la purificación de los complejos del PSI de vegetales transgénicos reveló que todas las versiones marcadas de la PSI-G se incorporaron y quedaron retenidas en el complejo del PSI, aunque se observó preferencia por la retención de las variantes de la PSI-G marcadas en el extremo C. Esto indica que la región del bucle de la PSI-G es importante para la integración adecuada en el núcleo del PSI. Nuestros experimentos demuestran que es posible producir un PSI marcado con His o Strep y brindan evidencia adicional sobre el hecho de que la topología de las proteínas de membrana está dictada por la distribución de las cargas positivas, que resisten la translocación entre las membranas. © 2005 FEBS.


Nielsen, A.D., Arleth, L., Westh, P.
“Interactions of Humicola insolens cutinase with an anionic surfactant studied by small-angle neutron scattering and isothermal titration calorimetry”
(Interacciones de la cutinasa de Humicola insolens con un surfactante aniónico estudiadas por dispersión de neutrones de ángulo pequeño y titulación por calorimetría isotérmica) Langmuir, 21 (10), pp. 4299-4307. (2005)

Resumen

Se estudió la interacción de la cutinasa de Humicula insolens (cutinase from Humicula insolens, HiC) y el dodecilsulfato sódico (sodium dodecyl sulphate, SDS) por dispersión de neutrones de ángulo pequeño (small-angle neutron scattering, SANS) y titulación por calorimetría isotérmica (isothermal titration calorimetry, ITC). La interpretación conjunta de la información estructural y termodinámica de los sistemas idénticos demostró ser valiosa en los intentos de elucidar los modos complejos de la interacción entre la proteína y el detergente. En particular, con la temperatura experimental a 22 °C, donde la formación de micelas de SDS es atérmica (ΔH = 0), y los efectos de las interacciones entre la proteína y el detergente se destacan claramente en los termogramas. Se observó que el efecto del SDS sobre la cutinasa dependía fuertemente de la composición de la muestra. Además, el agregado de SDS correspondiente a un cociente molar, nS = nSDS/n HiC de aproximadamente 10, se asoció con la formación de agregados de HiC/SDS, que incluyen más de una molécula de proteína. Los resultados de la SANS indicaron que, en promedio, estos aductos contenían dos HiC; las trazas de la ITC mostraron que se forman y degradan lentamente. Con concentraciones de SDS levemente mayores (ns = 10-25), los “dímeros” se disociaron y la proteína se desnaturalizó. La desnaturalización mostró el cambio característico en la entalpía positiva, pero el estado desnaturalizado con el SDS de la HiC resultó inusualmente compacto con un radio de giro cercano al de la conformación natural. Una mayor titulación con SDS se asoció con una unión exotérmica a la proteína desnaturalizada hasta el punto de saturación, a aproximadamente ns = 90. En este punto, la concentración del monómero libre era de 2,2 mM y el número de unión era de ∼40 SDS/HiC. Resulta interesante observar que este grado de unión al SDS (∼0,5 g de SDS/g de HiC) es menos de la mitad de la cantidad unida a las proteínas hidrosolubles típicas. © 2005 American Chemical Society.


Eriksson, J., Malmsten, M., Tiberg, F., Callisen, T.H., Damhus, T., Johansen, K.S.
“Model cellulose films exposed to H. insolens glucoside hydrolase family 45 endo-cellulase - The effect of the carbohydrate-binding module”
(Modelos de películas de celulosa expuestos a la endocelulosa de la familia 45 de glucosidasa de Humicola insolens: el efecto de la molécula de unión al hidrato de carbono) Journal of Colloid and Interface Science, 285 (1), pp. 94-99. (2005)

Resumen

Se investigaron los efectos de la actividad y la estructura de las enzimas sobre la degradación de los modelos de sustratos de celulosa por elipsometría de la celulasa de Humicola insolens de la familia GH45. Se observó que la variante inactiva D10N se adsorbe en la superficie de la celulosa pero también se incorpora en las películas de celulosa en una medida dependiente del pH. Para la proteína natural, a la adsorción inicial monitoreada de la variante inactiva D10N le siguió la degradación mediada por enzimas de las películas de celulosa. Nuevamente, se observó dependencia del pH, de modo que el valor más alto de pH producía una degradación enzimática más lenta. La eliminación del módulo de unión al hidrato de carbono eliminó la dependencia del pH pero esto también produjo una reducción en la adsorción a la superficie de la celulosa y un aumento del efecto catalítico neto. © 2004 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.


Ternström, T., Svendsen, A., Akke, M., Adlercreutz, P.
“Unfolding and inactivation of cutinases by AOT and guanidine hydrochloride”
(Despliegue e inactivación de las cutinasas por parte del AOT y del clorhidrato de guanidina) Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1748 (1), pp. 74-83. (2005)

Resumen

Se presenta un análisis comparativo del despliegue y la inactivación de tres cutinasas en presencia del clorhidrato de guanidina (GdnHCl) y el bis-2-etilhexil sulfosuccinato sódico (AOT). Las investigaciones previas se centraron en la cutinasa de Fusarium solani pisi (cutinase from Fusarium solani pisi, FsC). Además de FsC, este estudio incluyó la cutinasa de Humicola insolens (cutinase from Humicola insolens, HiC) y una variante mutante de la HiC (μHiC) con aumento de la actividad y disminución de la sensibilidad al surfactante. Se estudió la desnaturalización en estado de equilibrio y con resolución temporal por parte del AOT en una solución acuosa y en micelas reversas y se compararon con la desnaturalización por parte del GdnHCl. Los perfiles de desnaturalización por fluorescencia y por dicroísmo circular en el espectro UV lejano obtenidos en las soluciones acuosas de los dos desnaturalizantes coinciden para las tres cutinasas, lo que indica que el despliegue es un proceso colaborativo de dos estados en estas condiciones. En las micelas reversas, las cutinasas se despliegan con tasas monoexponenciales, lo que indica, nuevamente, que se trata de un proceso de dos estados. Se calculó la energía libre de la desnaturalización en agua por extrapolación lineal de los datos en estado de equilibrio, y se obtuvieron valores muy similares para las tres cutinasas, con promedios de -11,6 kcal mol-1 y -2,6 kcal mol-1 para el GdnHCl y el AOT, respectivamente. Por lo tanto, el estado desnaturalizado del AOT (DAOT) está menos desestabilizado que el estado desnaturalizado del GdnHCl (DGdnHCl), en relación con el estado natural en agua. La espectroscopía por dicroísmo circular en el espectro UV lejano reveló que el DAOT retiene cierta estructura secundaria mientras que el DGdnHCl carece básicamente de estructura. De manera similar, los datos de la fluorescencia indican que el DAOT es más compacto que el DGdnHCl. Las mediciones de la actividad indican que tanto el DAOT como el DGdnHCl son prácticamente inactivos (actividad catalítica < 1 % de la actividad de la enzima natural). El espectro de fluorescencia del DAOT en las micelas reversas no difirió significativamente del observado en el AOT en estado acuoso. Las resonancias magnéticas nucleares (nuclear magnetic resonance, NMR) del DAOT en las micelas reversas indicaron que la estructura es característica de un glóbulo derretido, lo que coincide con los datos obtenidos por CD y fluorescencia. © 2004 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.


Von Ossowski, I., Eaton, J.T., Czjzek, M., Perkins, S.J., Frandsen, T.P., Schülein, M., Panine, P., Henrissat, B., Receveur-Bréchot, V.
“Protein disorder: Conformational distribution of the flexible linker in a chimeric double cellulase”
(Alteración proteínica: distribución conformacional del conector flexible en una celulasa quimérica doble). Biophysical Journal, 88 (4), pp. 2823-2832. (2005)

Resumen

Se investigaron las propiedades estructurales del péptido conector que enlaza el módulo de unión a la celulosa con el módulo catalítico en celulasas bimodulares por dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Dado que el conector y el módulo de unión a la celulosa son relativamente pequeños y no pueden detectarse de manera sencilla por separado, se estudió la conformación del conector por medio de una proteína de fusión artificial, Cel6BA, en la cual un conector de 88 residuos enlaza los módulos catalíticos grandes de las celulasas Cel6A y Cel6B de Humicola insolens. Según nuestros datos, Cel6BA presenta una gran elongación con una dimensión máxima de 178 A, pero no fue posible describirla por una sola conformación. El modelado de una serie de conformadores de Cel6BA con separaciones interdominio de entre 10 Å y 130 Å demostró que se obtuvieron calces de perfil Guinier y P(r) adecuados con un promedio ponderado de las curvas de dispersión de todos los modelos, donde el conector sigue una distribución no aleatoria, con una preferencia por los conformadores más compactos. Es probable que estas propiedades estructurales sean esenciales para la función del conector como resorte molecular entre los dos módulos funcionales. Por lo tanto, la dispersión de rayos X de ángulo pequeño es una herramienta única para realizar el análisis cuantitativo de la alteración conformacional de las proteínas descrita como naturalmente desplegadas. © 2005 de Biophysical Society.


Maurus, R., Begum, A., Kuo, H.-H., Racaza, A., Numao, S., Andersen, C., Tams, J.W., Vind, J., Overall, C.M., Withers, S.G., Brayer, G.D.
“Structural and mechanistic studies of chloride induced activation of human pancreatic α-amylase”
(Estudios estructurales y mecánicos de la activación de la α-amilasa pancreática humana inducida por cloruro) Protein Science, 14 (3), pp. 743-755. (2005)

Resumen

Se estudió el mecanismo de la activación alostérica de la α-amilasa por parte del cloruro mediante experimentos estructurales y cinéticos que se centran en la variante dependiente del cloruro N298S de la α-amilasa pancreática humana (human pancreatic α-amylase, HPA) y una TAKA-amilasa independiente del cloruro. El análisis cinético de la variante de la HPA demuestra claramente el pronunciado efecto activador de la unión del ion de cloruro sobre las tasas de reacción y su efecto sobre la dependencia del pH por parte de la catálisis. Las alteraciones estructurales observadas en la variante N298S tras la unión al ion de cloruro tienen diversas funciones que sirven para fomentar la catálisis. Una de estas funciones es influir fuertemente sobre el posicionamiento del residuo E233 del catalizador ácido/básico. La ausencia del ion de cloruro produce conformaciones múltiples para este residuo y productos enzimáticos imprevistos. El ion de cloruro y la variante N298 también parecen estabilizar una región helicoidal de la cadena de polipéptidos desde la cual se proyecta el bucle flexible de unión al sustrato a las α-amilasas dependientes del cloruro. Esta característica estructural también sirve para orientar adecuadamente el residuo D300, que es catalíticamente esencial. Los análisis comparativos muestran que las α-amilasas independientes del cloruro compensan la ausencia del cloruro unido al reemplazar un núcleo hidrofóbico, alterando la manera en que se producen las interacciones de los sustratos y cambiando la colocación de la variante N298. Estas diferencias evolutivas surgen presuntamente en respuesta a los entornos operativos alternativos o a la ventaja obtenida en el perfil de un producto en particular. Los intentos de insertar la dependencia del cloruro en la TAKA-amilasa independiente del cloruro señalan la complejidad de este sistema y el hecho de que múltiples factores tienen una función en la unión del ion de cloruro en las α-amilasas dependientes del cloruro.


Høyrup, P., Callisen, T.H., Jensen, M.Ø., Halperin, A., Mouritsen, O.G.
“Lipid protrusions, membrane softness, and enzymatic activity”
(Protuberancias lipídicas, suavidad de la membrana y actividad enzimática) Physical Chemistry Chemical Physics, 6 (7), pp. 1608-1615. (2004)

Resumen

La actividad de la fosfolipasa A2 sobre las bicapas lipídicas exhibe un comportamiento de retardo-aceleración característico, el cual refleja las propiedades físicas del sustrato, como se demostró previamente. Aún se desconoce el mecanismo molecular subyacente responsable de este fenómeno. En este artículo se propone que las protuberancias de las moléculas lipídicas únicas fuera del plano bicapa podrían explicar dicho mecanismo. La propuesta está respaldada por una combinación de simulaciones dinámicas moleculares a escala atómica, teoría y experimentos que se llevaron a cabo para investigar, por un lado, la relación entre los modos de las protuberancias lipídicas y la suavidad mecánica de las bicapas fosfolipídicas y, por el otro, la actividad enzimática que actúa sobre las bicapas lipídicas compuestas de diferentes lípidos insaturados. Específicamente, nuestros experimentos demuestran una correlación entre la rigidez de flexión de la bicapa y la energía de activación de Arrhenius aparente extraída de los análisis sistemáticos del tiempo de retardo frente a la temperatura.


H.L. Bagger; C.C. Fuglsang; P. Westh. (2003)
“Preferential binding of two compatible solutes to the glycan moieties of Peniophora Lycii phytase.”
(Unión preferencial de dos solutos compatibles con los grupos glucanos de la fitasa de Peniophora Lycii) Biochemistry, 42, 10295-10300 (2003)

Resumen

Se ha sugerido que la regulación del comportamiento de la hidratación y los efectos concomitantes sobre la solubilidad y otras propiedades son una función principal de la glucosilación proteica. En este trabajo, se estudió la hidratación de la fitasa de Peniophora lycii sumamente glucolsilada en soluciones (0,15-1,1 m) de los dos solutos compatibles, glicerol y sorbitol. Las mediciones osmométricas mostraron que el glicerol se une preferentemente a la fitasa (es decir, que las interacciones entre el glicerol y la glucoproteína son más favorables que las interacciones entre el agua y la glucoproteína, lo que produce una acumulación preferencial del glicerol cercana a la interfaz proteica), mientras que el sorbitol se excluye preferentemente de la esfera de hidratación (las interacciones entre la glucoproteína y el agua son más favorables). Para evaluar las contribuciones de los grupos de hidratos de carbono y péptidos, respectivamente, se compararon la fitasa (Phy) y una forma modificada aunque enzimáticamente activa (dgPhy), en la cual se eliminaron el 90 % de los glucanos. Esto reveló que ambos polioles mostraron un grado pronunciado y aproximadamente equivalente de unión preferencial al grupo de hidratos de carbono. La unión preferencial de los polioles a los glucanos se contrasta con la exclusión de las interfaces peptídicas observadas aquí (para la dgPhy) y en numerosos informes previos sobre las proteínas no glucosiladas. A pesar de las diferencias claras entre los grupos de péptidos e hidratos de carbono, la glucosilación no afectó la acción estabilizante provista por el glicerol y el sorbitol. Sobre la base de esto, se concluyó que la capa de hidrato de carbono de la Phy es igualmente accesible en los estados natural y térmicamente desnaturalizado, respectivamente (muy probablemente, de acceso completo en ambos estados) y, en consecuencia, sus interacciones con solutos compatibles tienen un efecto pequeño o nulo sobre los equilibrios conformacionales de la glucoproteína. Por otro lado, para los equilibrios de solubilidad y agregación, los resultados indican una estabilización de las formas monoméricas inducida por el poliol.


A.D. Nielsen; C.C. Fuglsang; P. Westh.
“Effect of calcium ions on the irreversible denaturation of a recombinant Bacillus halmapalus alpha-amylase: a calorimetric investigation.”
(Efecto de los iones de calcio sobre la desnaturalización irreversible de una α-amilasa de Bacillus halmapalus recombinante: una investigación calorimétrica) Biochem. J., 373, 337-343 (2003)

Resumen

Se estudió el efecto de la temperatura y de los iones de calcio sobre la desnaturalización de una α-amilasa de Bacillus halmapalus (α-amylase from Bacillus halmapalus, BHA) recombinante por calorimetría. Se observó que la inactivación térmica de la BHA es irreversible y que los iones de calcio tienen un efecto significativo sobre la estabilidad. Por lo tanto, se observó una temperatura de desnaturalización (denaturation temperature, Td) aparente de 83 °C en presencia de iones de calcio en exceso, mientras que se observó una disminución de la Td a 48 °C con la eliminación del calcio. Se ha usado la diferencia en la estabilidad térmica con y sin iones de calcio para desarrollar un procedimiento de titulación por calorimetría isotérmica (isothermal titration calorimetry, ITC) que permite realizar una determinación simultánea de los parámetros cinéticos y los cambios en la entalpía de la desnaturalización de la BHA con agotamiento de calcio. Se halló una energía de activación EA de 101 kJ/mol para la desnaturalización de la BHA con agotamiento de calcio. Los resultados respaldan un mecanismo de desnaturalización cinética, donde la amilasa sin calcio se desnaturaliza irreversiblemente a una temperatura baja y, si existe un exceso de iones de calcio, la amilasa se desnaturaliza irreversiblemente a temperaturas elevadas. Ambas reacciones de desnaturalización se acoplan con el equilibrio de unión del calcio entre la amilasa unida al calcio y con agotamiento de calcio. Se ha usado una combinación de los resultados de la desnaturalización cinética y las constantes de unión al calcio, determinadas por ITC, para estimar la estabilidad cinética, expresada en términos de la vida media de la BHA como función de la temperatura y de la concentración sin iones de calcio. Por lo tanto, se estima que la EA aparente puede aumentar a, aproximadamente, 123 kJ/mol por el aumento de la concentración sin calcio.


A.D. Nielsen; M.L. Pusey; C.C. Fuglsang; P. Westh.
“A proposed mechanism for the thermal denaturation of a recombinant Bacillus halmapalus alpha-amylase--the effect of calcium ions.”
(Un mecanismo propuesto para la desnaturalización térmica de una α-amilasa de Bacillus halmapalus recombinante: efecto de los iones de calcio) Biochim. Biophys. Acta., 1652, 52-63 (2003)

Resumen

Se investigó la estabilidad térmica de una α-amilasa de Bacillus halmapalus (α-amylase from Bacillus halmapalus, BHA) recombinante por espectroscopia de dicroísmo circular (circular dichroism, CD) y calorimetría diferencial de barrido (differential scanning calorimetry, DSC). Esta α-amilasa es homóloga a otras α-amilasas de Bacillus en las cuales se realizaron estudios cristalográficos que identificaron, en la estructura, la existencia de tres sitios de unión al calcio. La desnaturalización de la BHA es irreversible con una T-m de aproximadamente 89 ºC; además, los termogramas de la DSC pueden describirse con un modelo de un paso irreversible. Se observó un aumento de 5 ºC en la T-m en presencia de un exceso de CaCl2 equivalente a 10 veces. Sin embargo, también se observó un aumento concomitante en la tendencia a la agregación. La presencia de un exceso de 30 a 40 veces de quelante de calcio (ácido etilendiaminotetraacético [EDTA] o ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N'N'-tetraacético [EGTA]) produce una gran desestabilización de la BHA, correspondiente a, aproximadamente, 40 ºC por debajo de la T-m según se determinó por CD y DSC. Un exceso de EGTA equivalente a 10 veces revela termogramas complejos de la DSC, correspondientes a las transiciones reversibles e irreversibles, que probablemente se originan de las diferentes poblaciones de complejos de BHA/calcio. La interpretación combinada de estas observaciones y la información estructural sobre las α-amilasas homólogas conforman la base para el mecanismo sugerido que subyacen el mecanismo de inactivación de la BHA. El mecanismo incluye la desnaturalización térmica irreversible de diferentes complejos de BHA/calcio y los equilibrios de unión al calcio. Asimismo, el modelo representa un cambio estructural reversible inducido por la temperatura y asociado con la unión al calcio.


F. Xu; E.J. Golightly; K.R. Duke; S.F. Lassen; B. Knusen; S. Christensen; K.M. Brown; S.H. Brown; M. Schulein.
“Humicola insolens cellobiose dehydrogenase: cloning, redox chemistry, and “logic gate”-like dual functionality.”
(Clonación, oxidorreducción y funcionalidad dual de tipo “puerta lógica” de la celobiosa deshidrogenasa de Humicola insolens) Enzyme and Microbial Technology, 28(9-10), 744-753 (2001)

Resumen

La celobiosa deshidrogenasa es una hemoflavoenzima que cataliza la transferencia secuencial de electrones desde un sustrato de donación de electrones (por ejemplo, la celobiosa) hasta un centro flavínico y luego hasta un sustrato que acepta electrones (por ejemplo, la quinona), ya sea de manera directa o a través de un centro hémico tras una transferencia interna de electrones desde el centro flavínico al hémico. Se clonó la deshidrogenasa de Humicola insolens, que codifica una proteína de 761 residuos aminoácidos que contienen un dominio hemo en el extremo N y un dominio Ravin en el extremo C, y se estudió la regulación de las transferencias de electrones catalizados. Sobre la base de la correlación entre la tasa y el potencial de oxidorreducción, se demostró que con un centro flavínico reducido, la enzima —como reductasa— podría exportar electrones desde el centro hémico mediante un mecanismo de “esfera exterior”. Sin embargo, con el centro flavínico “en descanso”, la enzima podría tener una función similar a la peroxidasa e importar electrones a su centro hémico tras la activación peroxidativa. La funcionalidad dual de su centro hémico hace que la enzima se convierta en una “puerta lógica”, a través de la cual puede modificarse la dirección del centro hémico por parte del estado de oxidorreducción del centro flavínico acoplado.


C.C. Fuglsang; R.M. Berka; J.A. Wahleithner; S. Kauppinen; J.R. Shuster; G. Rasmussen; T. Halkier; H. Dalbøge B. Henrissat.
“Biochemical analysis of recombinant fungal mutanases.”
(Análisis bioquímico de mutanasas fúngicas recombinantes) J. Biol. Chem. 275, 2009-2018 (2000)

Resumen

El análisis de secuenciación de nucleótidos muestra que las 1,3-glucanasas (mutanasas) de Trichoderma harzianum y de Penicillium purpurogenum tienen estructuras primarias homólogas (53 % de identificación de la secuencia de aminoácidos) y están conformadas por dos dominios diferentes: un dominio catalítico en el extremo NH2 y un dominio putativo de unión a los polisacáridos en el extremo COOH separados por un péptido conector O-glucosilado rico en Pro-Ser-Thr. Cada mutanasa se expresó en un huésped de Aspergillus oryzae bajo el control transcripcional de un promotor fuerte del gen α-amilasa. Las mutanasas purificadas recombinantes muestran un pH óptimo en el intervalo de pH de 3,5 a 4,5 y una temperatura óptima de aproximadamente 50-55 °C con un pH de 5,5. Además, exhiben una unión fuerte al mutano insoluble con una KD de aproximadamente 0,11 y 0,13°M con un pH de 7 para las mutanasas de Penicillium purpurogenum y Trichoderma harzianum, respectivamente. La hidrólisis parcial mostró que el dominio del extremo COOH de la mutanasa de Trichoderma harzianum se une al mutano. Se asignaron los dominios catalíticos y los dominios de unión a una nueva familia de glucosidasas y a una nueva familia de dominios de unión a los hidratos de carbono, respectivamente.