Damien Farrell, Helen Webb, Michael A. Johnston, Thomas A. Poulsen, Fergal O’Meara, Lars L. H. Christensen, Lars Beier, Torben V. Borchert, and Jens Erik Nielsen
Biochemistry, 2012, 51 (26), págs. 5339–5347
DOI: 10.1021/bi201926f
Fecha de publicación (Web): 6 de junio de 2012
Copyright © 2012 American Chemical Society

Resumen

“Toward Fast Determination of Protein Stability Maps: Experimental and Theoretical Analysis of Mutants of a Nocardiopsis prasina Serine Protease”
(Hacia la determinación rápida de los mapas de estabilidad de las proteínas: análisis experimental y teórico de mutantes de una proteasa de serina de Nocardiopsis prasina). La estabilidad de las proteasas de serina es de máxima importancia debido a su aplicación en los procesos industriales. En el presente estudio se analizaron los factores que determinan la estabilidad de una proteasa de serina de Nocardiopsis prasina utilizando ensayos de actividad residual rápidos, un algoritmo de clasificación de las características y algoritmos de cálculo de la energía basados en la estructura para 121 clones de enzimas mutantes micropurificados que contenían mutaciones en puntos múltiples. Utilizando un análisis de regresión multifactorial, deconvolucionamos los datos para los clones mutantes y hallamos que las mutaciones de los residuos Asn47 y Pro124 son deletéreos para la estabilidad de la enzima. Ambos residuos están situados en bucles que se sabe que son importantes para la estabilidad de la proteinasa α-lítica altamente homóloga. Los cálculos de energía basados en la estructura con PEATSA coinciden de forma general con la tendencia de los valores medidos de forma experimental, pero también identifican una cantidad de clones que el algoritmo no puede predecir correctamente. Discutimos la importancia de los resultados en relación con la estructura y la función de las proteinasas estrechamente relacionadas, comentamos el diseño experimental óptimo para realizar experimentos de alto rendimiento para caracterizar los factores determinantes de la estabilidad de las proteínas, y discutimos los resultados de los cálculos de energía basados en la estructura con conjuntos de datos complejos, como el que se presenta en este artículo.

 

Jones, A., Lamsa, M., Frandsen, T.P., Spendler, T., Harris, P., Sloma, A., Xu, F., Nielsen, J.B., Cherry, J.R.
“Directed evolution of a maltogenic α-amylase from Bacillus sp. TS-25”
(Evolución dirigida de una α-amilasa maltogénica de Bacillus sp. TS-25). Journal of Biotechnology, 134 (3-4), págs. 325-333. (2008)

Resumen

Se empleó la evolución dirigida en conjunto con una detección robótica de alto rendimiento para ampliar el uso industrial de la α-amilasa maltogénica Novamyl de Bacillus sp. TS-25. Novamyl natural se utiliza actualmente en la industria de la panadería como un agente que previene el envejecimiento de panes horneados con pH neutral o casi neutral. Sin embargo, la enzima se inactiva rápidamente durante el proceso de horneado del pan elaborado con recetas de pH bajo y, por lo tanto, Novamyl posee un efecto beneficioso muy limitado para esta aplicación en particular. En un esfuerzo por mejorar el rendimiento de Novamyl para las aplicaciones de pan con pH bajo, tales como la masa madre o el centeno, se generaron dos colecciones mediante la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) propensa a error, las cuales se expresaron en Bacillus subtilis y se analizaron en busca de variantes con mejor termoestabilidad y actividad en condiciones de pH bajo. Las variantes que exhibieron un mejor rendimiento se recombinaron de forma iterativa utilizando la transposición de ADN para crear dos generaciones de colecciones. Con respecto a Novamyl natural, algunas de las variantes resultantes exhibieron un aumento de más de 10 °C en la termoestabilidad con un pH de 4,5 y una de estas demostró importantes propiedades de antienvejecimiento con panes de pH bajo. © 2008 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Blanchard, S., Armand, S., Couthino, P., Patkar, S., Vind, J., Samain, E., Driguez, H., Cottaz, S.
“Unexpected regioselectivity of Humicola insolens Cel7B glycosynthase mutants”
(Regioselectividad imprevista de los mutantes de glicosintasa Cel7B de Humicola insolens). Carbohydrate Research, 342 (5), págs. 710-716. (2007)

Resumen

Se han evaluado cuatro mutantes de la glucosidasa Cel7B de Humicola insolens para el acoplamiento de fluoruro lactosil en O-alilo NI-acetilo-2II-azido-β-quitobiósido. Los mutantes dobles Cel7B E197A H209A y Cel7B E197A H209G catalizan preferiblemente la formación de un enlace β-(1→4) entre los dos disacáridos, en tanto el mutante único Cel7B E197A y el mutante triple Cel7B E197A H209A A211T producen de forma predominante el tetrasacárido enlazado con β-(1→3). Este resultado constituye el primer informe de la modulación de la regioselectividad a través de mutagénesis dirigida para una endoglicosintasa. © 2007 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

 

Blanchard, S., Cottaz, S., Coutinho, P.M., Patkar, S., Vind, J., Boer, H., Koivula, A., Driguez, H., Armand, S.
“Mutation of fungal endoglucanases into glycosynthases and characterization of their acceptor substrate specificity” (Mutación de endoglucanasas fúngicas en glicosintasas y caracterización de la especificidad del sustrato aceptor). Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 44 (3-4), págs. 106-116. (2007)

Resumen

El mutante Cel7B E197A de Humicola insolens es una poderosa endoglicosintasa que exhibe una especificidad del sustrato aceptor restringida para β-d-glucosilo, β-d-xilosilo, β-d-manosil y β-d-glucosaminil en el subsitio +1. Nuestro objetivo era extender la especificidad de este sustrato a β-d-N-acetilglucosaminil, con el fin de obtener acceso a una variedad más amplia de estructuras de oligosacáridos obtenidos a través de la síntesis asistida por la glicosintasa. En un primer enfoque, se acopló un trisacárido que portaba un residuo de β-d-N-acetilglucosaminil en el subsitio +1 de Cel7B de H. insolens, lo que indica que la mutación de solo un residuo, His209, podría generar la mayor especificidad del aceptor prevista. Se produjeron tres mutantes de glicosintasa Cel7B de H. insolens (H209A, H209G y H209A/A211T) que se expresaron en Aspergillus oryzae. En paralelo, las investigaciones de alineación de secuencias mostraron que muchas celulasas de la familia GH7 presentan un residuo de alanina, en lugar de histidina, en la posición 209. Se halló que entre ellas Cel7B de Trichoderma reesei, una endoglucanasa que comparte el mayor grado de identidad de secuencias con Cel7B de Humicola, acepta naturalmente un residuo de β-d-N-acetilglucosaminil en el subsitio +1. Se produjo y expresó el mutante Cel7B nucleófilo E196A de T. reesei en Saccharomyces cerevisiae, y su actividad como glicosintasa, junto con los mutantes de glicosintasa de H. insolens, se evaluaron para diversos aceptores glucosídicos. © 2006 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Eijsink, V.G.H., GÅseidnes, S., Borchert, T.V., Van Den Burg, B.
“Directed evolution of enzyme stability”
(La evolución dirigida de la estabilidad enzimática). Biomolecular Engineering, 22 (1-3), págs. 21-30. (2005)

Resumen

El desarrollo moderno de las enzimas se apoya cada vez más en las estrategias basadas en la generación de diversidad y la posterior detección de variantes con propiedades optimizadas. En principio, estas estrategias de evolución dirigida se pueden utilizar para optimizar cualquier propiedad enzimática, la cual se puede detectar de una forma económicamente viable, incluso si se desconoce la base molecular de la propiedad. La estabilidad es una propiedad interesante de las enzimas porque, en primer lugar, es muy importante a nivel industrial y, en segundo lugar, es relativamente fácil de detectar. Además, la base molecular de la estabilidad posee una estrecha relación con los problemas actuales de la ciencia de las proteínas, como el problema del plegamiento de las proteínas y las enfermedades que derivan de él. Por lo tanto, lograr estabilidad en las enzimas resulta de interés tanto para el ámbito comercial como para el campo científico. En este documento, revisamos cómo la evolución dirigida ha contribuido al desarrollo de enzimas estables y a una nueva visión con respecto a los principios de estabilidad de las proteínas. Se describen numerosos ejemplos recientes. Estos ejemplos muestran que la evolución dirigida es una estrategia efectiva para obtener enzimas estables, particularmente cuando se utiliza en conjunto con estrategias de ingeniería racionales o cuasi racionales. Con respecto a los principios de estabilidad de las proteínas, algunas lecciones importantes para aprender de los esfuerzos recientes en la evolución dirigida son, primero, que hay muchas formas estructurales de estabilizar una proteína, pero no siempre son fáciles de racionalizar; en segundo lugar, que las proteínas se pueden estabilizar optimizando sus superficies; en tercer lugar, que la alta estabilidad térmica se puede obtener sin perder el rendimiento catalítico a bajas temperaturas. © 2005 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

 

Tindbaek, N., Svendsen, A., Oestergaard, P.R., Draborg, H.
“Engineering a substrate-specific cold-adapted subtilisin”
(Ingeniería de una subtilisina adaptada al frío específica del sustrato). Protein Engineering, Design and Selection, 17 (2), págs. 149-156. (2004)

Resumen

Se realizó la transferencia informática de una región que se predijo que era altamente flexible para una enzima psicrofílica, la subtilisina TA39 (S39), a la subtilisina mesofílica savinase (EC 3.4.21.62) desde Bacillus lentus (clausii). El híbrido diseñado y savinase se investigaron inicialmente a través de simulaciones dinámicas moleculares a 300 K para demostrar la región de unión y flexibilidad global. La región S39 predicha consiste en 12 residuos que, debido a la homología entre las subtilisinas, provocan un cambio total de ocho residuos. A través de modificaciones dirigidas, la región se transfirió a la región de unión de savinase; por lo tanto, se construyó un híbrido de savinase-S39 denominado H5. El híbrido diseñado mostró el mismo nivel óptimo de temperatura y perfil de pH que savinase, pero H5 tuvo una mayor actividad específica en el sustrato sintético N-succinilo-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilido (AAPF) con todas las temperaturas medidas y, al mismo tiempo, H5 mostró una disminución en la termoestabilidad. El híbrido H5 mostró mayor especificidad del sustrato, la cual se midió a temperatura ambiente, debido a un aumento en la eficiencia catalítica en AAPF, AAPA y FAAF, en comparación con savinase (N-succinil-XXXX-pNA; XXXX = AAPF, AAPA y FAAF). El híbrido H5 mostró mayor actividad a temperatura baja y una mayor región de unión y flexibilidad global, como se investigó a través de simulaciones dinámicas moleculares, y desestabilización global a partir de mediciones por calorimetría de exploración diferencial. Estas características psicrofílicas indicaron un aumento de flexibilidad en el lugar de unión, probablemente debido a las modificaciones P129S, S130G, P131E y, por lo tanto, demostramos que es posible aumentar la actividad a temperatura baja y la flexibilidad global mediante una flexibilidad diseñada en la región de unión.

 

M. Schulein.
“Protein engineering of cellulases”
(Ingeniería proteica de las celulasas). Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1543(2), 239-252 (2000)

Resumen

Las celulasas son enzimas que hidrolizan las uniones beta -1, 4- glucosídicas de la celulosa. Pertenecen a 13 de las 82 familias de glucosidasas identificadas a través de análisis de secuencias, pero se dividen tradicionalmente en dos clases denominadas 'endoglucanasas' (EC 3.2.1.4) y 'celobiohidrolasas' (3.2.1.91). Ambos tipos de celulasas degradan las celodextrinas solubles y la celulosa amorfa pero, con algunas excepciones notables, solo las celobiohidrolasas degradan eficientemente la celulosa cristalina. La mutagénesis dirigida ha sido fundamental para la caracterización de las celulasas, oscilando entre la identificación y caracterización de residuos catalíticos putativos y de unión, la retención de los complejos de sustratos-enzimas mediante cristalografía hasta la construcción de nuevos y mejorados biocatalizadores, inclusive 'glicosintasas'. Pese a que los estudios sobre sustratos solubles y análogos de sustratos han proporcionado muchísima información, sigue siendo un gran desafío entender el mecanismo de degradación del sustrato natural, la celulosa cristalina.

 

F. Xu; A.E. Palmer; D.S. Yaver; R.M. Berka; G.A. Gambetta; S.H. Brown; E.I. Solomon.
“Targeted mutations in a Trametes villosa laccase: Axial perturbations of the T1 copper”
(Mutaciones dirigidas en una lacasa de Trametes villosa: perturbaciones axiales del cobre tipo 1). J. Biol. Chem., 274, 12372-12375 (1999)

Resumen

Se mutó la lacasa de Trametes villosa en un segmento de tetrapéptidos cercano al sitio de tipo 1. Las mutaciones F463M y F463L estaban en la posición correspondiente al ligando de metionina axial del cobre tipo 1 (M517) en el ascorbato oxidasa del zucchini. Las mutaciones E460S y A461E estaban cerca del sitio del cobre tipo 1. Las lacasas mutadas de Trametes se expresaron en el anfitrión Aspergillus oryzae y se caracterizaron. La mutación E460S no pudo producir un transformador con expresión significativa. Las mutaciones F463L y A461E no alteraron significativamente las propiedades moleculares y enzimológicas de la lacasa. Por el contrario, la mutación F463M dio como resultado un sitio de cobre tipo 1 con un valor intermedio de señal de la resonancia paramagnética de electrones (Electron Paramagnetic Resonance. EPR) entre el valor de la lacasa natural y la plastocianina, un espectro UV visible alterado y un menor potencial de reducción-oxidación (0,1 V). Al oxidar el sustrato fenólico, la mutación provocó un pH óptimo más básico y un aumento en kcat y Km. Estos efectos se atribuyen a una perturbación importante del centro de cobre tipo 1 causada por la coordinación del ligando de metionina axial (M463).

 

F. Xu; R.M. Berka; J.A. Wahleithner; B.A. Nelson; J.R. Shuster; S.H. Brown; A.E. Palmer; E.I. Solomon.
“Site-directed mutations in fungal laccase: Effect on redox potential, activity and pH profile”
(Mutaciones dirigidas en la lacasa fúngica: el efecto en el potencial de reducción-oxidación, actividad y perfil de pH). Biochem. J., 334, 63-70 (1998)

Resumen

Se mutaron una lacasa de Myceliophthora thermophila y una lacasa de Rhizoctonia solani en un segmento de pentapéptidos que se cree que está cerca del sitio de cobre tipo 1. La mutación L513F en la lacasa de Myceliophthora y la mutación L470F en la lacasa de Rhizoctonia se llevaron a cabo en una posición correspondiente al ligando de metionina axial del cobre tipo 1 (M517) en el ascorbato oxidasa del zucchini. Las mutaciones triples V509L,S510E,G511A en la lacasa de Myceliophthora y L466V,E467S,A468G en la lacasa de Rhizoctonia implicaron un segmento de secuencias cuyo homólogo en el ascorbato oxidasa está flanqueado por M517 y una histidina que liga al cobre tipo 1 (H512). La mutación única no generó cambios significativos en las propiedades enzímicas (incluso ningún aumento significativo en el potencial de reducción-oxidación del cobre tipo 1). Por el contrario, la mutación triple generó numerosos cambios significativos. En comparación con el tipo natural, los mutantes triples de las lacasas de Rhizoctonia y Myceliophthora tuvieron una actividad fenol oxidasa cuyo pH óptimo disminuyó y aumentó 1 unidad, respectivamente. Aunque los potenciales de reducción-oxidación no se alteraron de manera significativa, las inhibiciones de Km, kcat y fluoruro de las lacasas cambiaron significativamente a través de las mutaciones. Los efectos observados se interpretan como posibles perturbaciones estructurales inducidas por las mutaciones en el reconocimiento molecular entre el sustrato reductor y la lacasa, y en la transferencia de electrones desde el sustrato al centro de cobre tipo 1.