Camilla Christiansen, Maher Abou Hachem, Esben Friis, Martin J. Baumann, Mikkel A. Glaring, Anders Viksø-Nielsen, Bent W, Sigurskjold, Birte Svensson y Andreas Blennow
“Exploring New Plant Carbohydrate Binding Modules (CBMs) from Glucan, Water Dikinase”
(Exploración de nuevos módulos de unión a hidratos de carbono [CBM] vegetales a partir de glucanos, agua dicinasas). En: Starch Recent Progress in Biopolymer and Enzyme Technology. Tomasik, P., Bertoft, E. y Blennow A. (Editores). Polish Society of Food Technologists*, Capítulo 7, pp. 85-102, ISBN 978-83-902699-7-X (2008)

Resumen

Los dominios de unión al almidón (starch binding domains, SBD) son módulos distintivos que reconocen el almidón y suelen estar presentes en las enzimas activas de almidón. Los SBD se asignan en familias de módulos de unión a hidratos de carbono (carbohydrate binding module, CBM) sobre la base de las similitudes de las estructuras primarias y los pliegues estructurales conservados. Se encuentran SBD de la familia de CBM20 en las arqueas, las bacterias y los eucariontes, y se producen junto con una variedad de dominios catalíticos en las α-amilasas, β-amilasas, ciclodextrina glucosil transferasas, glucoamilasas, pululanasas, glucanos, agua dicinasas (water dikinases, GWD) y otras enzimas. Tradicionalmente, los SBD facilitan la unión de las enzimas hidrolíticas extracelulares a los gránulos de almidón y se consideran motivos importantes para el desarrollo de enzimas con actividades nuevas y mejoradas para la degradación eficaz del almidón. Los miembros de la familia de CBM45, descubierta recientemente, están presentes de manera exclusiva en las α-amilasas de plástidos, cuya función se desconoce, y en las GWD involucradas en la fosforilación del almidón. Es interesante observar que la GWD de plástidos de Arabidopsis thaliana GWD3 tiene un SBD que pertenece a la familia CBM20. Se clonó y produjo el SBD de GWD3 para lograr una mayor caracterización y comparar las propiedades de unión con la familia CBM20 de glucoamilasa (GA) de Aspergillus niger debidamente caracterizada. Se midió la unión de β-ciclodextrina, un imitador del almidón de bajo peso molecular, y de otros ligandos solubles por resonancia de plasmones superficiales y se utilizó una microscopía confocal de barrido láser para visualizar la unión a los gránulos de almidón. El SBD de GWD3 de Arabidopsis thaliana mostró una afinidad 70 veces inferior a la β-ciclodextrina que el SBD de GA. La baja afinidad de estos CBM intracelulares vegetales en comparación con la mayoría de los demás SBD, incluida la familia CBM20 de Aspergillus niger, sugieren que las enzimas vegetales que contienen SBD tienen una unión reversible o regulada. Este es el primer informe sobre un miembro aislado de la familia vegetal CBM20 y resalta la presencia de diferencias funcionales dentro de la CBM20.

 

Micheelsen, P.O., Vévodová, J., De Maria, L., Østergaard, P.R., Friis, E.P., Wilson, K., Skjøt, M.
“Structural and Mutational Analyses of the Interaction between the Barley α-Amylase/Subtilisin Inhibitor and the Subtilisin Savinase Reveal a Novel Mode of Inhibition”
(Análisis estructurales y mutacionales de la interacción entre el inhibidor de α-amilasa de cebada/subtilisina y la subtilisina Savinase revelan un modo de inhibición novedoso). Journal of Molecular Biology. Artículo en prensa. (2008)

Resumen

Las subtilisinas representan una clase importante de proteinasas de serina microbianas. Hasta el momento, existen estructuras tridimensionales de inhibidores proteínicos de tres familias que conforman un complejo con las subtilisinas en el banco de datos de proteínas (Protein Data Bank). Todas interactúan con la subtilisina por un bucle expuesto que cubre seis residuos de interacción. En este artículo, se presenta la estructura cristalina del complejo formado entre la subtilisina de Bacillus lentus Savinase y el inhibidor de α-amilasa de cebada/subtilisina (barley α-amylase/subtilisin inhibitor, BASI). Esta es la primera vez que se informa sobre un inhibidor de cereales de la familia Kunitz-P en un complejo con la subtilisina. Según el análisis estructural, el BASI inhibe la Savinase de forma novedosa, dado que el bucle de interacción es más corto que los bucles informados anteriormente. Según el análisis mutacional, Thr88 es crucial para la inhibición, ya que estabiliza el bucle de interacción mediante interacciones intramoleculares con la cadena principal del BASI. © 2008 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

 

Skálová, T., Dohnálek, J., Østergaard, L.H., Østergaard, P.R., Kolenko, P., Dušková, J., Hašek, J.
“Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the small laccase from Streptomyces coelicolor”
(Cristalización y análisis de difracción de rayos X preliminar de la pequeña lacasa de Streptomyces coelicolor). Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 63 (12), pp. 1077-1079. (2007)

Resumen

Se cristalizó la pequeña lacasa bacteriana de la actinobacteria Streptomyces coelicolor, que carece del segundo de los tres dominios de las lacasas cuyas estructuras se han caracterizado hasta la fecha. Esta fenoloxidasa, que contiene átomos múltiples de cobre, se cristaliza en una red cristalina tetragonal primitiva con los siguientes parámetros de celda unitaria: a = b = 179,8; c = 175,3 Å. Los cristales pertenecen al grupo espacial cristalino P41212 o P43212. La función de autorrotación muestra la presencia en la estructura de un eje triple no cristalográfico. Las fases se determinarán a partir de la señal anómala de los iones de cobre presentes originalmente. © International Union of Crystallography 2007.

 

Gloster, T.M., Ibatullin, F.M., Macauley, K., Eklöf, J.M., Roberts, S., Turkenburg, J.P., Bjørnvad, M.E., Jørgensen, P.L., Danielsen, S., Johansen, K.S., Borchert, T.V., Wilson, K.S., Brumer, H., Davies, G.J.
“Characterization and three-dimensional structures of two distinct bacterial xyloglucanases from families GH5 and GH12”
(Caracterización y estructuras tridimensionales de dos xiloglucanasas bacterianas diferentes de las familias GH5 y GH12). Journal of Biological Chemistry, 282 (26), pp. 19177-19189. (2007)

Resumen

La pared celular vegetal es un material complejo en el cual las microfibrillas de celulosa se encuentran incrustadas dentro de una malla de otros polisacáridos, que a veces se denominan ampliamente “hemicelulosas”. Una de estas hemicelulosas es el xiloglucano, que tiene una cadena principal de D-glucosa unida por un enlace β-1,4 reemplazada con grupos de xilosa, galactosa y, ocasionalmente, fucosa. Tanto el xiloglucano como las enzimas responsables de su modificación y degradación son cada vez más prominentes, lo que refleja el avance hacia la conversión de la biomasa enzimática, su función en las aplicaciones de detergentes y la utilidad de los xiloglucanos modificados en la modificación de las fibras de celulosa. En este artículo, se presentan la caracterización enzimática y las estructuras tridimensionales de las formas del complejo de oligosacáridos-xiloglucanos sin ligandos de dos xiloglucanasas diferentes de las familias GH5 y GH12 de glucósido hidrolasas. Las enzimas, Paenibacillus pabuli XG5 y Bacillus licheniformis XG12, exhiben surcos centrales activos abiertos injertados en los pliegues respectivos (β/α)8 y β-jelly (lámina β curvada sobre sí misma), en los cuales podrían acomodarse las “decoraciones” de la cadena lateral del xiloglucano. Para la topología de la enzima β-jelly roll de la familia GH12, se tolera la unión de los grupos xilosilo y galactosilo colgante, pero la enzima es similarmente competente para la degradación de los glucanos no ramificados. En el caso de la enzima (β/α)8 de la familia GH5, se producen interacciones cinéticamente productivas con los sustituyentes de xilosilo y galactosilo, como se refleja en la actividad muy específica sobre el xilogrulano y la cinética de una serie de glucósidos del grupo arilo. Las estrategias diferenciales para que se acomoden las cadenas laterales del xiloglucano supuestamente facilitan la acción de estas hidrolasas microbianas en ambientes donde pueden encontrarse sustratos sustituidos diversos y diferentes. © 2007 de The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

 

Greenbaum, J.A., Andersen, P.H., Blythe, M., Bui, H.-H., Cachau, R.E., Crowe, J., Davies, M., Kolaskar, A.S., Lund, O., Morrison, S., Mumey, B., Ofran, Y., Pellequer, J.-L., Pinilla, C., Ponomarenko, J.V., Raghava, G.P.S., Van Regenmortel, M.H.V., Roggen, E.L., Sette, A., Schlessinger, A., Sollner, J., Zand, M., Peters, B.

“Towards a consensus on datasets and evaluation metrics for developing B-cell epitope prediction tools”
(Hacia el consenso sobre los conjuntos de datos y las medidas de evaluación para desarrollar herramientas de predicción de los epítopos de células B). Journal of Molecular Recognition, 20 (2), pp. 75-82. (2007)

Resumen

Un epítopo de células B es una estructura tridimensional dentro de un antígeno que puede unirse a la región variable de un anticuerpo. Resultaría muy conveniente lograr la predicción de los epítopos de células B para diversas aplicaciones inmunológicas, pero se observaron desafíos únicos en el campo de la inmunología y de la bioinformática. Para mejorar la precisión de los métodos de predicción de los epítopos de células B se depende del consenso de la comunidad con respecto a los datos y la métrica utilizados para desarrollar y evaluar estas herramientas. Recientemente, se llevó a cabo un taller en Washington D. C., patrocinado por el Instituto Nacional de Alergias y de Enfermedades Infecciosas (National Institute of Allergy and Infectious Disease, NIAID), a fin de analizar el estado actual del campo de predicción de los epítopos de células B. Se relevaron muchas de las herramientas disponibles en la actualidad y se trazó un conjunto de recomendaciones para facilitar mejoras en las herramientas existentes y para acelerar el desarrollo de herramientas futuras. Uno de los ejes subyacentes de las recomendaciones hechas por el panel es la mayor colaboración entre los grupos de investigación. Con el desarrollo de conjuntos de datos comunes, formatos de datos unificados y los medios para consolidar la información, esperamos optimizar en gran medida el desarrollo de las herramientas de predicción de los epítopos de células B. Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd.


Mirza, O., Skov, L.K., Sprogøe, D., Van Den Broek, L.A.M., Beldman, G., Kastrup, J.S., Gajhede, M.
“Structural rearrangements of sucrose phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis during sucrose conversion”
(Reconfiguraciones estructurales de la sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis durante la conversión de sacarosa). Journal of Biological Chemistry, 281 (46), pp. 35576-35584. (2006)

Resumen

Se estudió el mecanismo de reacción de la sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis (BiSP) por mutagénesis dirigida y cristalografía de rayos X. Se cocristalizó un mutante inactivo de BiSP (E232Q) junto con la sacarosa. La estructura reveló un modo de unión al sustrato similar al observado en otras enzimas que actúan sobre la sacarosa. También se cristalizó la bacteria BiSP natural en presencia de sacarosa. En la estructura dimérica, se formó un intermediario covalente de glucosilo en una molécula del dímero de BiSP; después de la hidrólisis del intermediario de glucosilo, se formó un complejo de β-D-glucosa en la otra molécula. Si bien la estructura general del complejo intermedio de BiSP-glucosilo es similar a la del complejo de BiSP(E232Q)-sacarosa, el complejo de glucosa muestra diferencias mayores en las conformaciones de bucles. Dos bucles (residuos 336-344 y 132-137) en la proximidad del sitio activo se trasladan a las posiciones 16 y 4 Å, respectivamente. Sobre la base de estos hallazgos, se sugiere un ciclo de reacción que considera los movimientos importantes en los bucles de entrada del sitio activo. © 2006 de The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Lyhne-Iversen, L., Hobley, T.J., Kaasgaard, S.G., Harris, P.
“Structure of Bacillus halmapalus α-amylase crystallized with and without the substrate analogue acarbose and maltose”
(Estructura de α-amilasa de Bacillus halmapalus cristalizada con y sin el sustrato análogo acarbosa y maltosa). Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 62 (9), pp. 849-854. (2006)

Resumen

Se estudió la α-amilasa de Bacillus halmapalus (Bacillus halmapalus α-amylase, BHA) recombinante en dos formas cristalinas diferentes. La primera forma cristalina se obtuvo por cristalización de la BHA a temperatura ambiente en presencia de acarbosa y maltosa. Los datos se obtuvieron a temperatura criogénica con una resolución de 1,9 Å. Se observó que el cristal pertenecía al grupo espacial cristalino P21212 1, con los siguientes parámetros de celda unitaria: a = 47,0; b = 73,5; c = 151,1 Å. Se observó una molécula de maltosa que se unía a la BHA y se confirmaron los informes previos sobre la unión de un nonasacárido. La segunda forma cristalina se obtuvo por cristalización de la BHA inducida por el pH en un amortiguador de ácido bórico-MES-HEPES (amortiguador de MHB) a 303 K; la solubilidad de la BHA en el amortiguador de MHB depende de la temperatura de manera retrógrada, por lo que la cristalización de la BHA fue solo posible elevando la temperatura a, por lo menos, 298 K. Los datos se obtuvieron a una temperatura criogénica con una resolución de 2,0 Å. El cristal pertenecía al grupo espacial cristalino P2 12121, con los siguientes parámetros de celda unitaria: a = 38,6; b = 59,0; c = 209,8 Å. La estructura se resolvió por reemplazo molecular. Se describe el sitio de unión a la maltosa y se comparan ambas estructuras. No se observaron cambios significativos en la estructura de los sustratos luego de la unión. © 2006 International Union of Crystallography. Todos los derechos reservados.

 

Von Ossowski, I., Eaton, J.T., Czjzek, M., Perkins, S.J., Frandsen, T.P., Schülein, M., Panine, P., Henrissat, B., Receveur-Bréchot, V.
“Protein disorder: Conformational distribution of the flexible linker in a chimeric double cellulase”
(Alteración proteínica: distribución conformacional del conector flexible en una celulasa quimérica doble). Biophysical Journal, 88 (4), pp. 2823-2832. (2005)

Resumen

Se investigaron las propiedades estructurales del péptido conector que enlaza el módulo de unión a la celulosa con el módulo catalítico en celulasas bimodulares por dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Dado que el conector y el módulo de unión a la celulosa son relativamente pequeños y no pueden detectarse de manera sencilla por separado, se estudió la conformación del conector por medio de una proteína de fusión artificial, Cel6BA, en la cual un conector de 88 residuos enlaza los módulos catalíticos grandes de las celulasas Cel6A y Cel6B de Humicola insolens. Según nuestros datos, Cel6BA presenta una gran elongación con una dimensión máxima de 178 A, pero no fue posible describirla por una sola conformación. El modelado de una serie de conformadores de Cel6BA con separaciones interdominio de entre 10 Å y 130 Å demostró que se obtuvieron calces de perfil Guinier y P(r) adecuados con un promedio ponderado de las curvas de dispersión de todos los modelos, donde el conector sigue una distribución no aleatoria, con una preferencia por los conformadores más compactos. Es probable que estas propiedades estructurales sean esenciales para la función del conector como resorte molecular entre los dos módulos funcionales. Por lo tanto, la dispersión de rayos X de ángulo pequeño es una herramienta única para realizar el análisis cuantitativo de la alteración conformacional de las proteínas descrita como naturalmente desplegadas. © 2005 de Biophysical Society.

 

Davies, G.J., Marek Brzozowski, A., Dauter, Z., Rasmussen, M.D., Borchert, T.V., Wilson, K.S.

“Structure of a Bacillus halmapalus family 13 α-amylase, BHA, in complex with an acarbose-derived nonasaccharide at 2.1 Å resolution” (Estructura de α-amilasa de Bacillus halmapalus, BHA, de la familia 13 que forma un complejo con un nonasacárido derivado de acarbosa con una resolución de 2,1 Å). Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 61 (2), pp. 190-193. (2005)

Resumen

La digestión enzimática del almidón por parte de las α-amilasas es una de las reacciones biotecnológicas clave de los últimos tiempos. En la búsqueda de biocatalizadores industriales, se clonó y expresó la α-amilasa BHA de Bacillus halmapalus de la familia GH13. Se determinó que la estructura tridimensional con una resolución de 2,1 Å formaba un complejo con el inhibidor (seudo)tetrasacárido acarbosa. La acarbosa se halla unido como producto nonasacárido de la transglucosilación que abarca los subsitios -6 a +3. El estudio atento de la densidad de los electrones indica que el ligando unido no podría haberse formado por las transglucaciones sucesivas de la acarbosa y también debe haber exhibido maltosa o maltooligosacáridos como aceptador. © 2005 International Union of Crystallography. Todos los derechos reservados.

 

Ryttersgaard, C., Le Nours, J., Lo Leggio, L., Jørgensen, C.T., Christensen, L.L.H., Bjørnvad, M., Larsen, S.
“The structure of endo-β-1,4-galactanase from Bacillus licheniformis in complex with two oligosaccharide products”
(La estructura de la endo-β-1,4-galactanasa de Bacillus licheniformis que forma un complejo con dos productos oligosacáridos). Journal of Molecular Biology, 341 (1), pp. 107-117. (2004)

Resumen

La β-1,4-galactanasa de Bacillus licheniformis (BLGAL) es una enzima vegetal que degrada la pared celular implicada en la hidrólisis del β-1,4-galactano en las regiones densas (“hairy”) de la pectina. Se determinó la estructura cristalina de la BLGAL por reemplazo molecular, sola y en forma de complejo con los productos galactobiosa y galactotriosa, lo que permitió la apreciación cristalográfica inicial de los fragmentos de β-1,4-galactano. Como se prevé para una enzima que pertenece a la familia GH53, la estructura de la BLGAL exhibe una arquitectura en forma de barril (βα)8. Sin embargo, los bucles 2, 7 y 8 de βα de la BLGAL son largos, en contraste con los bucles correspondientes de las estructuras de la galactanasas fúngicas previamente determinadas. La estructura de la BLGAL también muestra un ion de calcio que se enlaza a los bucles largos 7 y 8 de βα, que reemplaza un enlace disulfuro en las galactanasas fúngicas. En comparación con los subsitios de unión al sustrato previstos para la galactanasa de Aspergillus aculeatus (AAGAL), en la BLGAL se encuentran dos subsitios adicionales de unión al sustrato, -3 y -4. La comparación del patrón de degradación del galactano y los galactooligosacáricos por parte de la AAGAL y la BLGAL muestra que, si bien ambas tienen mayor actividad en los sustratos con un nivel elevado de polimerización, la AAGAL degrada la galactotriosa y la galactotetraosa de manera eficaz, mientras que la BLGAL prefiere los oligosacáridos más largos y no hidroliza la galactotriosa en ninguna medida apreciable. Esta diferencia en relación con la preferencia del sustrato puede explicarse estructuralmente debido a la presencia de los subsitios adicionales -3 y -4 en la BLGAL. © 2004 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

 

McAuley, K.E., Svendsen, A., Patkar, S.A., Wilson, K.S.
“Structure of a feruloyl esterase from Aspergillus niger”
(Estructura de una feruloil esterasa de Aspergillus niger). Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 60 (5), pp. 878-887. (2004)

Resumen

Se determinó la estructura cristalográfica de una feruloil esterasa de Aspergillus niger con una resolución de 1,5 Å por reemplazo molecular. La proteína tiene una estructura α/β-hidrolasa con la tríada catalítica Ser-His-Asp; el pliegue general de la proteína es muy similar al de las upasas fúngicas. Se determinó la estructura del complejo formado por la enzima y el producto con una resolución de 1,08 Å, y se observaron conformaciones dobles con los residuos de serina e histidina en el sitio activo. © 2004 International Union of Crystallography. Impreso en Dinamarca. Todos los derechos reservados.

 

J. Le Nours; C. Ryttersgaard; L.L. Leggio; P.R. Østergaard; T.V. Borchert; L.L.H. Christensen; S. Larsen.
“Structure of two fungal beta-1,4-galactanases: Searching for the basis for temperature and pH optimum.“
(Estructura de dos β-1,4-galactanasas fúngicas: la búsqueda de la base de los valores óptimos de temperatura y pH). Protein Science, 12, 1195-1204 (2003)

Resumen

Las β-1, 4-galactanasas hidrolizan las cadenas laterales de galactano que forman parte de la estructura glucídica compleja de la pectina. Se las asigna a la familia 53 de las glucosidasas y exhiben variaciones significativas en su estabilidad y en sus valores óptimos de pH y temperatura. Se clonaron y expresaron de manera heteróloga dos β-1, 4-galactanasas de Myceliophthora thermophila y Humicola insolens, y se determinaron las estructuras cristalinas de los productos génicos. Se compararon las estructuras con la estructura de la única familia conocida previamente, la familia 53 de la galactanasa de Aspergillus aculeatus (galactanase from Aspergillus aculeatus, AAGAL), y se observó una identidad similar al 56 %. Las galactanasas de Myceliophthora thermophila y de Humicola insolens son enzimas termofílicas y exhiben su mayor actividad con un pH neutro o básico, mientras que la AAGAL es mesofílica y exhibe su mayor actividad con un pH ácido. Se determinó la estructura de la galactanasa de Myceliophthora thermophila (Myceliophthora thermophila galactanase, MTGAL) a partir de cristales obtenidos con amortiguadores de HEPES y TRIS con una resolución de 1,88 Å y 2,14 Å, respectivamente. Se determinó la estructura de la galactanasa de Humicola insolens (Humicola insolens galactanase, HIGAL) con una resolución de 2,55 Å. La termoestabilidad de la MTGAL y la HIGAL se correlaciona con el aumento en la rigidez de la proteína y las interacciones electroestáticas, la estabilización de las hélices alfa y la envoltura más ajustada. Con una inspección de los sitios activos en las tres enzimas, se identificaron varias sustituciones de aminoácidos que podrían explicar la variación en el valor óptimo de pH. Una evaluación de la actividad como función del pH del mutante D182N de la AAGAL y del mutante A90S/H91D de la MTGAL mostró que la diferencia en el valor óptimo de pH entre la AAGAL y la MTGAL está asociada, al menos en parte, con las diferencias en la naturaleza de los residuos en las posiciones 182, 90 o 91.

 

W. Receveur; M. Czjzek; M. Schulein; P. Panine; B. Henrissat.
“Dimension, shape, and conformational flexibility of a two domain fungal cellulase in solution probed by small angle X- ray scattering”
(Dimensión, forma y flexibilidad conformacional de dos celulasas fúngicas de dominio en una solución exploradas por dispersión de rayos X de ángulo pequeño). J. Biol. Chem., 277(43), 40887-40892 (2002)

Resumen

La celulasa Ce145 de Humicola insolens tiene una estructura modular, con un módulo catalítico y un módulo de unión a la celulosa (cellulose-binding module, CBM) separados por un péptido conector glucosilado de 36 aminoácidos. Se estudiaron la conformación de la solución de la proteína Ce145 de dos dominios en su totalidad y el efecto de la longitud y la flexibilidad del conector sobre el ordenamiento espacial de los módulos constitutivos por dispersión de rayos X de ángulo pequeño con la estructura tridimensional conocida de los módulos individuales. Según las dimensiones medidas de la enzima, el conector muestra una conformación extendida que conduce a una extensión máxima entre los dos centros de masa de cada módulo correspondiente a, aproximadamente, cuatro unidades celobiosas en una cadena de celulosa. La glucosilación del conector es el factor clave que define su conformación extendida. Además, se observó que una mutación en un tramo de cinco prolinas en el conector le confiere mayor rigidez a la enzima. Según nuestro estudio, lo más probable es que el posicionamiento correspondiente del módulo catalítico y del CBM en el sustrato insoluble esté afectado por la estructura y la flexibilidad del conector. Nuestros resultados coinciden con un modelo en el que las celulasas se mueven por la superficie de la celulosa en forma de oruga sin restricciones de energía.

 

J. E. Nielsen; T. V. Borchert; G. Vriend.
“The determinants of alpha-amylase pH activity profiles”
(Los determinantes de los perfiles de actividad del pH de la α-amilasa). Protein engineering, 14, 505-512 (2001)

Resumen

Las glucosidasas presentan una gran familia de enzimas muy relevantes para la industria. Por lo tanto, resulta de interés la ingeniería de las enzimas de esta familia para lograr un rendimiento óptimo en condiciones muy diversas. Hasta hace poco tiempo, las adaptación de las glucosidasas para procesos industriales específicos implicaba, ante todo, lograr su estabilidad; sin embargo, últimamente también surgió interés por la ingeniería de los perfiles de la actividad del pH. Se mutaron cuatro residuos neutros (N190, F290, N326 y Q360) en la α-amilasa de Bacillus Ba2 quimérica en aminoácidos neutros y cargados. Según los resultados, el perfil de actividad del pH de la α-amilasa de Ba2 puede modificarse al insertar residuos cargados en el sitio activo. Sin embargo, los cambios en el perfil de actividad del pH en estas mutaciones de neutro --> cargado no se correlacionan con las predicciones de los cálculos de los valores de pK(a) de los residuos del sitio activo. Lo que es aún más sorprendente, las mutaciones neutro --> neutro modifican el perfil de actividad del pH tanto como las mutaciones neutro --> cargado. A partir de estos resultados, se concluye que otros factores, además de la electrostática —posiblemente los aspectos dinámicos del sitio activo— son importantes para la forma de los perfiles de actividad del pH de las α-amilasas.

 

E. Sabini; K.S: Wilson; S. Danielsen; M. Schulein; G.J. Davies.
“Oligosaccharide binding to family 11 xylanases: both covalent intermediate and mutant product complexes display B-2,B-5 conformations at the active centre”
(Unión de oligosacáridos a las xilanasas de la familia 11: los complejos de productos intermedios covalentes y mutantes exhiben conformaciones B-2,B-5 en el centro activo). Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 57, 1344-1347 (2001)

Resumen

La clasificación basada en la secuencia de glucosidasas muestra dos familias de enzimas que hidrolizan la cadena principal del xilano unido a β-1, 4, las xilanasas, familias denominadas GH-10 y GH-11. Las xilanasas de la familia GH-11 son interesantes porque la catálisis se realiza por un producto intermedio covalente que adopta una conformación B-2, B-5 (bote) inusual, una conformación que también satisface las restricciones estereoquímicas del estado de transición a un ion similar a un oxocarbenio. Aquí se presenta la estructura de 1,9 Å de un nucleófilo, E94A, mutante de Xyn11 de Bacillus agaradhaerens que forma un complejo con la xilotriosa. De manera interesante, este complejo también adopta la conformación B-2, B-5 en el subsitio -1, con un espacio desocupado provisto por la mutación Glu --> Ala que permite que el azúcar adopte la configuración alfa en C1. La estructura del producto intermedio covalente de la enzima 2-deoxi-2-fluoroxilobiosilo se extendió a una resolución atómica (1,1 Å).
K. Zhu; A. Jutila; E.K.J. Tuominen; S.A. Patkar; A. Svendsen; P.K.J. Kinnunen.
“Impact of the tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability”
(Impacto de los residuos de triptófano de la lipasa de Humicola lanuginosa sobre su estabilidad térmica). Biochim. Biophys. Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology, 1547, 329-338 (2001)

Resumen

Se comparó la estabilidad térmica de la lipasa de Humicola lanuginosa natural (wild type Humicola lanuginosa lipase, wt HLL) y sus dos mutantes, W89L y el mutante único de Trp W89m (W117F, W221H y W260H). La calorimetría diferencial de barrido mostró el despliegue de la HLL a T-d = 74,4 ºC, mientras que para W89L y W89m esta actividad endotérmica se redujo a 68,6 y 62 ºC, respectivamente, lo que demuestra la contribución significativa de los residuos de Trp antes mencionados a la estabilidad estructural de la HLL. Los espectros de emisión de fluorescencia mostraron que el microambiente promedio de los triptófanos de wt HLL y W89L se tornan más hidrofílicos a temperaturas elevadas, mientras que con W89m, ocurrió lo contrario. Estos cambios en la emisión en estado de equilibrio fueron bruscos, con puntos medios (T-m) a aproximadamente 70,5 ºC, 61,0 ºC y 65,5 ºC para la wt HLL, W89L y W89m, respectivamente. Asimismo, la espectroscopía de fluorescencia en estado de equilibrio y con resolución temporal indicaron que, tras el aumento de la temperatura, los movimientos locales del o de los triptófano(s) en estas lipasas se atenuaban en primer lugar. Sin embargo, las movilidades más aceleradas se hicieron evidentes cuando se superaron las temperaturas de despliegue (T-m), y las lipasas se hicieron menos compactas, como se indica por el aumento de los radios hidrodinámicos. Incluso con temperaturas elevadas (hasta 85 ºC), se observó un alcance significativo de la estructura secundaria y terciaria por dicroísmo circular. Las mediciones de la actividad coinciden con el aumento de las amplitudes de las fluctuaciones conformacionales de la HLL con la temperatura. Según nuestros resultados, el despliegue térmico de estas lipasas no es un proceso de dos estados sino que implica estados intermedios. Cabe mencionar que un ciclo de calentamiento y enfriamiento realzó la actividad de las lipasas, lo que sugiere que la proteína está atrapada en un estado intermedio de mayor energía. Estos datos muestran que las mutaciones, en especial W89L en la tapa, contribuyen considerablemente a la estabilidad, la estructura y la actividad de la HLL.

 

L. Beier; A. Svendsen; C. Andersen; T. P. Frandsen; T. V. Borchert; J.R. Cherry.
“Conversion of the maltogenic alpha-amylase into a CGT'ase”
(Conversión de la α-amilasa maltogénica en una CGTasa). Protein Engineering ,13, 509-513 (2000)

Resumen

Novamyl es una α-amilasa maltogénica termoestable de cinco dominios que muestra una secuencia y una estructura homólogas a las de las ciclodextrina glucosiltransferasas (CGTasas). Al comparar las estructuras cristalinas de Novamyl y las CGTasas por rayos X, se observaron dos diferencias importantes en la fisura del sitio activo: Novamyl contiene una inserción de bucle de cinco residuos (residuos 191-195) y la ubicación de un residuo aromático conocido por ser esencial para obtener una reacción de ciclación eficaz. Para convertir Novamyl en una enzima que produzca ciclodextrina (CD), se eliminó el bucle y se introdujeron dos sustituciones, F188L y T189Y. A diferencia del Novamyl original, la variante obtenida puede producir β-CD y mostró una conversión general del almidón a CD del 9 %, en comparación con las CGTasas, que pueden convertir hasta el 40 %. La menor conversión en comparación con la CGTasa se debe, probablemente, a las diferencias adicionales en la fisura del sitio activo y en el dominio E de unión al almidón. Una variante con solo la eliminación del bucle de cinco residuos no logró formar β-CD.

 

A.M. Brzozowski; H. Savage; C.S. Verma; J.P.D.M. Lawson; A. Svendsen; S.A. Patkar.
“Structural origins of the interfacial activation on Thermomyces (Humicola) lanuginosa lipase”
(Orígenes estructurales de la activación interfacial sobre la lipasa de Thermomyces [Humicola] lanuginosa). Biochemistry, 39,15071-15082 (2000)

Resumen

Las estructuras de las lipasas conocidas por rayos X brindan evidencia escasa sobre las etapas estructurales iniciales separadas que ocurren en las primeras fases de su activación en presencia de lípidos (proceso denominado activación interfacial). Para abordar este problema, se resolvieron cinco estructuras cristalinas de lipasa de Thermomyces (anteriormente Humicola) lanuginosa (Thermomyces lanuginosa lipase, TIL) y se las comparó con cuatro estructuras de esta enzima informadas anteriormente. El sesgo que surge de los diferentes medios de cristalización se minimizó con el desarrollo de todos los cristales en las mismas condiciones de cristalización, en presencia de análogos de detergentes/lípidos, con una fuerza iónica baja o alta como la única variable principal. Las estructuras resultantes y sus características típicas permitieron identificar tres especies de esta enzima que son estructuralmente distintivas: forma con actividad baja (low activity, LA), forma activada (activated, A) y forma totalmente activa (fully active, FA). La isomerización del disulfuro Cys268-Cys22, sincronizada con la formación de una nueva hélice alfa corta (0), y la inversión de Arg84 (cambio de arginina) ubicada en la región bisagra (hinge) proximal de la compuerta, se han postulado como los factores estructurales clave de la transición inicial entre las formas LA y A. Los resultados experimentales se complementaron con cálculos teóricos. La magnitud de la barrera de activación entre las formas LA (estado base) y A (estado final) de TIL (10,6 kcal/mol) es comparable con las barreras entálpicas que son típicas de las inversiones de anillos y las isomerizaciones del disulfuro a temperatura ambiente. Esto sugiere que la secuencia de cambios estructurales, como se ejemplifica en diversas estructuras de cristales de TlL, coincide con las que pueden ocurrir durante la activación interfacial.