Reichwald, K., Hatzack, F.
"Application of a modified Haug and Lantzsch method for the rapid and accurate photometrical phytate determination in soybean, wheat, and maize meals"
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (9), pp. 2888-2891. (2008)

Resumo

Uma versão modificada do método de Haug e Lantzsch para a determinação fotométrica rápida de fitato foi aplicada à análise de fitato em farelo de soja, trigo e milho. Em comparação com o protocolo original, a quantidade de reagente tóxico ácido tioglicólico é substancialmente reduzida para minimizar potenciais riscos à saúde da equipe laboratorial. Foram testadas diferentes condições de extração para o farelo de soja, e a fervura por pelo menos 30 minutos foi necessária para remover um composto interferente dos extratos de farelo de soja. Os teores de fítatos determinados de acordo com o método modificado de Haug e Lantzsch não diferiram daqueles obtidos através da medição de fósforo total precipitado ou por cromatografia iônica sensível e específica de alto desempenho. A aplicabilidade e a precisão do método modificado para a análise de fitato nos principais substratos de ração animal, incluindo proteína vegetal texturizada à base de soja, foram demonstradas. © 2008 American Chemical Society.

 

Olesen, K.-M., Hansen, S.H., Sidenius, U., Schmiegelow, K.
"Determination of leukocyte DNA 6-thioguanine nucleotide levels by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection"
Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 864 (1-2), pp. 149-155. (2008)

Resumo

Foi desenvolvido um método de HPLC para a determinação do nucleotídeo 6-tioguanina no DNA. O DNA de leucócitos foi isolado do sangue periférico, derivado com cloroacetaldeído, e os derivados formados de eteno N2,3-eteno 6-tioguanina (ε6TG), 1, N6-eteno adenina (εA) e N2,3-eteno guanina (εG) foram liberados da estrutura do DNA por hidrólise a pH 6,0 e 80 °C durante 60 min. Após a extração de ε6TG por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC, na sua sigla em inglês), a amostra foi analisada por HPLC de fase reversa de par iônico com detecção de fluorescência. O limite de quantificação foi de 9,0 nM, e a precisão intra e entre dias variou de 2,8 a 15,5%. Em uma pequena coorte de oito crianças com leucemia linfoblástica aguda (LLA), uma mediana de uma base 6-tioguanina foi encontrada para cada 3 mil bases normais (intervalo 1:2.000–1:11.000). © 2008 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Gizzi, G., Thyregod, P., Von Holst, C., Bertin, G., Vogel, K., Faurschou-Isaksen, M., Betz, R., Murphy, R., Andersen, B.B.
"Determination of phytase activity in feed: interlaboratory study"
Journal of AOAC International, 91 (2), pp. 259-267. (2008)

Resumo

Foi realizado um estudo interlaboratorial para determinar as características de desempenho de um novo método para a determinação da atividade da fitase em amostras de ração. O método tem como base o princípio de que fosfato inorgânico é liberado a partir do substrato fitato sob condições de ensaio definidas, e foi validado pela sua adequação para medir a atividade enzimática de vários produtos de fitase. Foram aplicados dois designs experimentais de estudo diferentes, permitindo a estimativa da precisão do método sob condições de repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade, respectivamente. O desvio padrão relativo para a repetibilidade (RSDr, na sua sigla em inglês) variou de 2,2 a 10,6%, e o RSD para reprodutibilidade (RSDR, na sua sigla em inglês) variou de 5,4 a 15%. A adequação do método validado para o objetivo pretendido foi demonstrada. O perfil de desempenho obtido do método validado neste estudo foi comparável ao de métodos semelhantes que foram validados exclusivamente para um produto de fitase.

 

Zarnkow, M., Mauch, A., Back, W., Arendt, E.K., Kreisz, S.
"Proso millet (Panicum miliaceum L.): An evaluation of the microstructural changes in the endosperm during the malting process by using scanning-electron and confocal laser microscopy"
Journal of the Institute of Brewing, 113 (4), pp. 355-364. (2007)

Resumo

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia confocal por varredura a laser (CLSM, na sua sigla em inglês) foram utilizadas para investigar as alterações microestruturais no endosperma durante o processo de maltagem. A MEV foi uma ferramenta adequada para caracterizar a constituição microestrutural de grânulos de amido no painço e as alterações que ocorrem durante a maltagem. Uma possível degradação visível (após 24 h) dos grânulos de amido localizados no endosperma farináceo, próximo ao embrião, pode ser observada. Devido a essa degradação, utilizando a microscopia confocal por varredura a laser, observou-se um empacotamento menos denso dessa parte do endosperma. A degradação de grânulos de amido no endosperma vítreo foi óbvia em um estágio posterior distinto da maltagem (78 h), e foi detectado um ataque preferido de grânulos pequenos (<2,5 μm). Não puderam ser detectadas alterações na estrutura proteica por MEV ou CLSM. © 2007 The Institute of Brewing & Distilling.

 

Poulsen, L.K., Pedersen, M.H., Dufva, M.
"Allergology on a chip"
Clinical and Experimental Allergy, 37 (12), pp. 1736-1737. (2007)

Kim, K.-H., Brown, K.M., Harris, P.V., Langston, J.A., Cherry, J.R.
"A proteomics strategy to discover β-glucosidases from Aspergillus fumigatus with two-dimensional page in-gel activity assay and tandem mass spectrometry"
Journal of Proteome Research, 6 (12), pp. 4749-4757. (2007)

Resumo

A produção economicamente competitiva de etanol a partir de biomassa lignocelulósica por hidrólise enzimática e fermentação é atualmente limitada, em parte, pelo custo relativamente alto e baixa eficiência das enzimas necessárias para hidrolisar a celulose a açúcares fermentáveis. A descoberta de novas celulases com maior atividade poderia ser uma etapa crítica para superar essa barreira de custos. A β-glicosidase catalisa a etapa final na conversão de polímeros de glicose em glicose. Apesar de sua importância, apenas algumas β-glicosidases estão comercialmente disponíveis, e é necessário o desenvolvimento de enzimas mais eficientes. Desenvolvemos uma estratégia proteômica com o objetivo de descobrir as β-glicosidases presentes no proteoma secretado do fungo que degrada celulose Aspergillus fumigatus. Com o uso de condições de desnaturação proteica parcial ou total, o proteoma secretor foi fracionado em um formato 2DGE, e a atividade da β-glicosidase foi detectada no gel após a infusão com um análogo de substrato que fluoresce após a hidrólise. Os pontos fluorescentes foram submetidos à digestão tríptica, e a identificação como β-glicosidases foi confirmada por espectrometria de massas em tandem. Duas β-glicosidases novas de A. fumigatus foram identificadas por esse método de coloração de atividade in situ, e o gene que codifica uma nova β-glicosidase (EAL88289) foi clonado e expresso heterologicamente. A β-glicosidase expressada apresentou estabilidade ao calor muito superior às β-glicosidases de Aspergillus niger e Aspergillus oryzae, caracterizadas anteriormente. A estabilidade térmica melhorada é importante para o desenvolvimento da próxima geração de enzimas sacarificantes capazes de realizar reações rápidas de hidrólise de celulose a temperaturas elevadas, reduzindo, assim, o custo da produção de bioetanol. A abordagem de coloração de atividade in situ descrita aqui seria uma ferramenta útil para catalogar e avaliar a eficiência das β-glicosidases com elevado rendimento. © 2007 American Chemical Society.

 

Råvik, M., Cimander, C., Elofsson, U., Veide, A.
"A method for microbial cell surface fingerprinting based on surface plasmon resonance"
Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70 (4), pp. 595-604. (2007)

Resumo

É sugerido um método para a impressão digital da superfície das células microbianas usando ressonância plasmática de superfície (SPR, na sua sigla em inglês). Quatro mutantes diferentes de Escherichia coli foram utilizados como células modelo. As impressões digitais da superfície celular foram geradas pelo registro da interação entre os mutantes celulares e quatro superfícies diferentes, com diferentes propriedades físicas e químicas, quando uma suspensão celular percorre a superfície. Foram observadas diferenças significativas no padrão de impressão digital entre alguns dos mutantes. Ao mesmo tempo, as propriedades físicas das superfícies celulares foram determinadas usando microeletroforese, medidas angulares de contato e partição aquosa de duas fases e comparadas às impressões digitais de SPR. As impressões digitais da superfície celular e os dados de propriedades físicas gerados foram avaliados com análise de dados multivariados que demonstraram que as células foram separadas em grupos individuais de forma semelhante usando gráficos de análise de componente principal (PCA, na sua sigla em inglês). © 2007 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Haack, M.B., Lantz, A.E., Mortensen, P.P., Olsson, L.
"Chemometric analysis of in-line multi-wavelength fluorescence measurements obtained during cultivations with a lipase producing Aspergillus oryzae strain"
Biotechnology and Bioengineering, 96 (5), pp. 904-913. (2007)

Resumo

O fungo filamentoso Aspergillus oryzae foi cultivado em lotes e lotes alimentados para investigar o uso de fluorescência de múltiplos comprimentos de onda para o monitoramento de eventos durante os cultivos de fungos filamentosos. A cepa de A. oryzae aplicada expressou uma lipase fúngica de Thermomyces lanuginosus. Foram coletados espectros de fluorescência de múltiplos comprimentos de onda a cada 5 min com o sistema Bio View® (DELTA, Dinamarca), e foram construídos ambos os modelos explorativos e preditivos correlacionando os dados de fluorescência com a atividade de lipase e a massa celular. Durante os cultivos, A. oryzae exibiu crescimento de hifas dispersas e, nessas condições, não foi observada nenhuma sujeira do sensor de fluorescência de múltiplos comprimentos de onda. As pontuações de um modelo de análise de fator paralelo (PARAFAC, na sua sigla em inglês), com base nos espectros de fluorescência, evidenciaram, por exemplo, o início da fase de alimentação. Os modelos preditivos, estimando a massa celular, exibiram correlações entre 0,73 e 0,97, com erro quadrático médio dos valores de validação cruzada (RMSECV, na sua sigla em inglês) entre 1,48 e 0,77 g · kg-1. Um modelo que estimou a atividade da lipase também foi construído para os cultivos de lotes alimentados com uma correlação de 0,93. Os resultados apresentados aqui demonstram claramente que a fluorescência de múltiplos comprimentos de onda é uma ferramenta útil para monitorar os cultivos de lotes alimentados de fungos filamentosos. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.

 

Sonesson, A.W., Callisen, T.H., Brismar, H., Elofsson, U.M.
"A comparison between dual polarization interferometry (DPI) and surface plasmon resonance (SPR) for protein adsorption studies"
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 54 (2), pp. 236-240. (2007)

Resumo

Este trabalho foi realizado com o objetivo de comparar os resultados de adsorção proteica obtidos da interferometria de polarização dupla (DPI, na sua sigla em inglês) recentemente desenvolvida com a técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR, na sua sigla em inglês) bem estabelecida. Ambas as técnicas utilizam um campo evanescente como elemento de detecção, mas utilizam métodos completamente diferentes para calcular a massa adsorvida. Como um sistema de testes, utilizamos a adsorção da lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) nas superfícies C18. A quantidade adsorvida calculada com ambas as técnicas está em bom acordo, com ambas as isotermas de adsorção com saturação a 1,30–1,35 mg/m2 a concentrações de TLL de 1.000 nM e superiores. Portanto, isso suporta o uso da SPR e DPI como ferramentas para o estudo da adsorção proteica, que é muito importante na comparação dos dados de adsorção obtidos com o uso de técnicas diferentes. Devido à detecção de pontos na SPR, essa técnica é recomendada para estudos cinéticos iniciais, enquanto a DPI é mais precisa quando o índice de refração e a espessura da camada adsorvida são de maior interesse. © 2006 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

Houmøller, L.P., Kristensen, D., Rosager, H.
"Determination of SFC, FFA, and equivalent reaction time for enzymatically interestified oils using NIRS"
Talanta, 71 (2), pp. 868-873. (2007)

Resumo

Foi investigado o uso de espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS, na sua sigla em inglês) para determinação rápida do grau de interesterificação de misturas de estearina de palma, óleo de coco e óleo de colza obtidas utilizando uma lipase de Thermomyces lanuginosa imobilizada a 70 °C. A interesterificação foi realizada através da aplicação de ambos reatores de lote e de leito fixo. As calibrações foram desenvolvidas para a determinação quantitativa do teor de gordura sólida (SFC, na sua sigla em inglês) a 10, 20, 30, 35 e 40 °C e ácido graxo livre (AGL), resultando em erros quadráticos médios de predição de 1,0; 1,3; 1,4; 1,6; 1,7 e 0,19% (p/p), respectivamente. Os dados demonstraram que a NIRS poderia ser usada para substituir os métodos tradicionais para a determinação de AGL e SFC em óleos vegetais. Foi possível monitorar a atividade da enzima imobilizada para a interesterificação de óleos de margarina ao prever o tempo de reação equivalente em um reator de lote dos espectros de NIR. Os erros quadráticos médios da predição para duas misturas de óleos diferentes interesterificadas por 300 e 170 min foram 21 e 12 minutos, respectivamente. © 2006 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F.
"Analysis of phosphorus and phosphorylated compounds in the context of plant physiology and global phosphorus management: A review"
Current Analytical Chemistry, 2 (4), pp. 421-430. (2006)

Resumo

A gestão do fósforo (P) como recurso não renovável está recebendo atenção crescente no início do novo milênio. A importância do fosfato como nutriente, a carga ambiental de fosfato em áreas com produção intensiva de gado e o esgotamento dos recursos de fosfato de alta qualidade estão acentuando a necessidade de uma gestão holística e global dos recursos de fósforo e a compreensão dos papéis fisiológicos, biossíntese e degradação dos compostos fosforilados nas plantas. Duas rotas importantes para uma melhor gestão de recursos de P são a engenharia genética das plantas em relação à biodisponibilidade melhorada de P e a aplicação de fitases microbianas para aumentar a biodisponibilidade de fitato-P em animais monogástricos. A presente revisão fornece uma visão geral sobre essas abordagens de gestão de P e discute o arsenal de técnicas analíticas que podem ser usadas para analisar P e compostos de P. Essa capacidade analítica é um determinante importante no desenvolvimento de abordagens mais avançadas e mais efetivas para a gestão de recursos de P. © 2006 Bentham Science Publishers Ltd.

 

Mejlhede, N., Kyjovska, Z., Backes, G., Burhenne, K., Rasmussen, S.K., Jahoor, A.
"EcoTILLING for the identification of allelic variation in the powdery mildew resistance genes mlo and Mla of barley"
Plant Breeding, 125 (5), pp. 461-467. (2006)

Resumo

Nesta investigação, descreve-se a implementação bem-sucedida de uma técnica de detecção de mutação baseada em CEL I para a descoberta e a detecção de polimorfismo de DNA nos genes mlo e Mla de cevada. A técnica é chamada EcoTILLING, que é um método de alto rendimento para detectar e descobrir novas mutações pontuais e pequenas inserções/deleções no DNA. O método não só revela o polimorfismo entre diferentes alelos, mas também pode ser usado como um poderoso marcador genético. Os genes mlo e Mla estão envolvidos na defesa da cevada contra o oídio de patógeno fúngico. O gene de resistência do oídio mlo é um gene de cópia única, enquanto que há múltiplos alelos no locus Mla. Com EcoTILLING, foi possível identificar mutações pontuais e deleções em cada um dos 11 mlo mutantes testados. Para Mla, 25 variantes de cevada natural foram testadas e, embora a identificação tenha sido complexa devido à presença de parálogos altamente semelhantes de Mla, a maioria dos alelos recentemente identificados de Hordeum vulgare ssp. spontaneum foram identificados. Este método oferece a possibilidade de combinar diferentes alelos mlo com diferentes alelos Mla de cevada selvagem para obter cultivares com maior resistência. © 2006 The Authors.

 

Jürgen, B., Barken, K.B., Tobisch, S., Pioch, D., Wümpelmann, M., Hecker, M., Schweder, T.
"Application of an electric DNA-chip for the expression analysis of bioprocess-relevant marker genes of Bacillus subtilis"
Biotechnology and Bioengineering, 92 (3), pp. 299-307. (2005)

Resumo

O conhecimento de genes críticos relevantes para o processo pode ser usado para um melhor controle de bioprocessos. Até o momento, os genes marcadores relevantes para bioprocessos podem ser analisados por métodos de análise de expressão estabelecidos apenas fora de linha. Neste estudo, sugere-se uma abordagem alternativa para um potencial monitoramento em linha da expressão de genes durante os bioprocessos. Esta abordagem baseia-se na medição de mRNAs específicos em um chip de DNA elétrico em conexão com uma hibridização em sanduíche com base em grânulos magnéticos. A fim de permitir uma medição em linha de mRNAs específicos, um método melhorado para um isolamento rápido e parcialmente automatizado de amostras de RNA de alta qualidade foi desenvolvido. A análise de expressão do chip de DNA elétrico foi comparada com microarranjos de DNA óptico e RT-PCR em tempo real para três genes selecionados de Bacillus subtilis relevantes para o processo. Demonstramos que a análise de mRNA por meio do chip de DNA elétrico oferece resultados semelhantes em comparação com a análise de microarranjo a técnica de RT-PCR em tempo real. © 2005 Wiley Periodicals, Inc.

 

Ignatjev, I., Valincius, G., Švedaite, I., Gaidamauskas, E., Kažemekaite, M., Razumas, V., Svendsen, A.
"Direct amperometric determination of lipase activity"
Analytical Biochemistry, 344 (2), pp. 275-277. (2005)

Valincius, G., Ignatjev, I., Niaura, G., Kažemékaité, M., Talaikyté, Z., Razumas, V., Svendsen, A.
"Electrochemical method for the detection of lipase activity"
Analytical Chemistry, 77 (8), pp. 2632-2636. (2005)

Resumo

Uma nova técnica eletroquímica para o ensaio geral da atividade da lipase é descrita. O método utiliza um substrato de lipase suportado de forma sólida, que é formado por gotejamento e secagem de uma pequena quantidade de uma solução de etanol de dissulfeto de 9-(5'-ferrocenilpentanoiloxi)nonilo (FPONDS, na sua sigla em inglês) em ouro modificado por uma monocamada automontada com hexanotiol. O grupo redox ferroceno de FPONDS gera o sinal eletroquímico, cuja intensidade é proporcional ao número de moléculas de FPONDS na interface. Os dados da espectroscopia de absorção no infravermelho realçada pela superfície melhorada e da espectroscopia eletroquímica, bem como de experiências de controle com uma enzima mutante desativada, demonstram que a lipase do tipo selvagem de Thermomyces lanuginosus é capaz de clivar as ligações éster de moléculas da FPONDS através de um mecanismo de hidrólise enzimática que inclui a adsorção da lipase na superfície do substrato. A hidrólise libera os grupos ferroceno da interface, desencadeando a diminuição do sinal redox eletroquímico. A taxa de diminuição do sinal eletroquímico é proporcional à atividade/concentração da lipase. Esses dados sugerem um método geral para a medição direta da atividade enzimática das lipases. © 2005 American Chemical Society.

 

Mortensen, P.P., Esbensen, K.H.
"Optimization of the Angle Measure Technique for image analytical sampling of particulate matter"
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 75 (2), pp. 219-229. (2005)

Resumo

Foi realizada a otimização de uma aplicação analítica de imagem industrial que utiliza a técnica de medição de ângulo (AMT, na sua sigla em inglês) como parte integrante da estimativa do nível de pó do parâmetro de qualidade para grânulos de enzimas encapsuladas. Os principais resultados da AMT deste estudo podem ser generalizados para todos os tipos semelhantes de segregação de matéria particulada. A primeira parte do estudo aborda estratégias de amostragem de pixels dentro de uma imagem antes da aplicação da técnica de medição de ângulo, onde a imagem desdobrada é considerada como um objeto unidimensional. Os parâmetros ótimos para o algoritmo da AMT são uma amostragem sistemática ou estratificada de mais de 500 pontos de iniciação desdobrados de uma nova forma espiral ou serpenteada a partir da imagem fluorescente; esse novo procedimento de desdobramento elimina certos artefatos algorítmicos "envolventes" que não precisaram de retificação até agora. A segunda parte é direcionada para o delineamento de amostragem analítica de imagens ideais de uma série dessas imagens, ou seja, otimização da amostragem do processo de imagem. O número mínimo de imagens necessárias para manter uma estimativa on-line suficientemente boa do parâmetro de CQ (controle de qualidade) em questão é correspondente a uma taxa de amostragem relativamente alta de 15–20%, relacionada a um nível de erro intrínseco de medição de um método de referência analítica obrigatório. O aumento do número de incrementos de imagem incluídos na amostra analítica da imagem afeta principalmente o rigor das estimativas, enquanto a precisão é muito menos afetada, o que atesta uma estabilidade satisfatória do método analítico de imagens desenvolvido, que se encontra em implementação industrial. © 2004 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Stocks, S.M.
"Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight"
Cytometry Part A, 61 (2), pp. 189-195. (2004)

Resumo

Introdução: A BacLight (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) é um corante popular de dois componentes baseado em fluorescência para determinar a viabilidade celular bacteriana. O objetivo principal deste estudo foi elucidar completamente o mecanismo e determinar por que, às vezes, há relatos de coloração de células vivas e mortas ao mesmo tempo. Métodos: As soluções de DNA foram submetidas a coloração com os dois componentes, iodeto de propídio (PI) e SYTO 9, em diferentes combinações, e os espectros de fluorescência foram coletados. Resultados: KPl e KSYTO9 foram aproximadamente 3,7 x 105/M e 1,8 x 105/M. As emissões de SYTO9 foram mais fortes e se sobrepuseram às emissões de PI. Foi observada a transferência ressonante de energia por fluorescência de SYTO9 para PI. Mesmo em condições normais, foi possível para o SYTO9 ligado ao DNA ter um componente na região vermelha igual àquele do PI ligado ao DNA. Verificou-se que emissões potencialmente confusas ocorreram quando o PI não estava em excesso suficiente para saturar o ácido nucleico (> 0,4 ​​M PI para pares de bases de DNA de 1 M). Conclusões: O mecanismo é uma combinação de deslocamento de SYTO9 por PI e redução de emissões de SYTO9 por transferência ressonante de energia por fluorescência. Resultados confusos podem ocorrer se as intensidades das colorações ou a concentração de PI em relação ao ácido nucleico não forem devidamente contabilizadas. © 2004 Wiley-Liss, Inc.

 

Hansen, E., Mollerup, J.M.
"The influence of retention on the plate height in ion-exchange chromatography"
Separation Science and Technology, 39 (9), pp. 2011-2030. (2004)

Resumo

As alturas de placas para o aminoácido tirosina (troca de ânions) e a aprotinina polipeptídica (troca de cátions) foram determinadas em um meio poroso (Resource 15) e um meio preenchido com gel (HyperD 20) a concentrações de sal que variaram de retenção fraca a forte. A uma velocidade constante, as medidas mostraram que a altura da placa aumentou com uma retenção crescente, passou por um máximo e, finalmente, diminuiu à medida que a retenção aumentou, isto é, quando a concentração de sal baixou ainda mais. A ampliação da faixa de um pico cromatográfico na coluna foi causada pela dispersão axial e pela transferência de massa. Neste artigo, a taxa de transferência de massa nas partículas é descrita por três mecanismos de taxa diferentes: difusão por poros, difusão sólida e difusão paralela. A equação Van Deemter foi usada para modelar os dados para determinar as propriedades de transferência de massa. O desenvolvimento da altura da placa com retenção crescente revelou um comportamento característico para cada mecanismo de taxa. No modelo de difusão por poros, a altura da placa aumentou em direção a um valor constante em forte retenção, enquanto, no modelo de difusão sólida, a altura da placa diminuiu, aproximando-se de um valor constante em forte retenção. No modelo de difusão paralela, ocorreu tanto difusão por poros quanto difusão sólida. Portanto, o modelo de difusão paralela coincide com o modelo de difusão por poros em retenção fraca e com o modelo de difusão sólida em forte retenção, enquanto que um máximo é alcançado a retenção intermediária, resultando em uma curva em forma de sino. Esse comportamento corresponde à variação observada em relação à altura da placa em velocidade constante. Nem o modelo de difusão por poros nem o modelo de difusão sólida podem descrever os dados experimentais, enquanto um ajuste satisfatório foi obtido utilizando o modelo de difusão paralela.

 

Klenø, T.G., Andreasen, C.M., Kjeldal, H.Ø., Leonardsen, L.R., Krogh, T.N., Neilsen, P.F., Sørensen, M.V., Jensen, O.N.
"MALDI MS peptide mapping performance by in-gel digestion on a probe with prestructured sample supports"
Analytical Chemistry, 76 (13), pp. 3576-3583. (2004)

Resumo

A espectrometria de massa de dessorção/ionização por laser (tandem) assistida por matriz (MALDI MS, na sua sigla em inglês) é amplamente utilizada na pesquisa de química de proteínas e proteômica para identificação e caracterização de proteínas isoladas por eletroforese em gel de poliacrilamida. Em um esforço para minimizar o manuseio da amostra e aumentar a produção da amostra, desenvolvemos um novo protocolo de digestão em gel em que a preparação da amostra é realizada diretamente em uma sonda MALDI com suporte de amostra pré-estruturada. O protocolo consiste em poucas etapas de tratamento das amostras e tem um consumo mínimo de reagentes, tornando o protocolo sensível, com economia de tempo e com bom custo-benefício. O desempenho do protocolo de preparação de amostras na sonda foi demonstrado pela análise de um conjunto de proteínas do fígado de ratos obtidas a partir de um gel de poliacrilamida bidimensional com corante fluorescente (Cy3 e SyproRuby). A taxa de sucesso da identificação de proteínas por digestão tríptica em sonda e por mapeamento de massa de peptídeos MALDI foi de 89%. O procedimento de digestão em gel em sonda forneceu sensibilidade superior e desempenho de mapeamento de massa de peptídeos em comparação com o nosso protocolo padrão de digestão em gel. A técnica de digestão em sonda resultou em uma cobertura de sequência de aminoácidos significativamente melhorada de proteínas, principalmente devido à recuperação eficiente e à detecção de peptídeos hidrofóbicos grandes (<1,5 kDa). Essas observações indicam que inúmeros peptídeos trípticos são perdidos quando se utilizam métodos padrão de digestão em gel e técnicas de preparação de amostras para MALDI MS. Este estudo também demonstra que o protocolo de digestão em sonda combinado com a espectrometria de massa tandem de MALDI fornece uma plataforma robusta para pesquisa proteômica, incluindo a identificação de proteínas e a determinação de modificações pós-translacionais.

 

Grotkjær, T., Åkesson, M., Christensen, B., Gombert, A.K., Nielsen, J.
"Impact of Transamination Reactions and Protein Turnover on Labeling Dynamics in 13C-Labeling Experiments"
Biotechnology and Bioengineering, 86 (2), pp. 209-216. (2004)

Resumo

Um modelo dinâmico que descreve as transições de átomos de carbono no metabolismo central de Saccharomyces cerevisiae é usado para investigar a influência das reações de transaminação e do turnover proteico no comportamento transitório de experimentos com o quimiostato de marcação 13C. As simulações realizadas sugerem que a troca de carbono devido à transaminação e ao turnover proteico pode aumentar significativamente o tempo necessário para que os metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA, na sua sigla em inglês) atinjam o estado estável isotópico, o que está de acordo com observações experimentais publicadas. Por outro lado, a transaminação e o turnover proteico acelerarão a taxa líquida de incorporação de carbono marcado em alguns aminoácidos livres e ligados a proteínas. Os resultados da simulação indicam que o padrão de incorporação de carbono marcado em aminoácidos obtidos a partir de hidrolisado de biomassa demostra desvio significativo do comportamento de cinética de primeira ordem comumente presumido até depois de três tempos de residência. Essas observações sugerem que deve haver maior precaução ao se apontar novas oportunidades no delineamento e na interpretação de experimentos de marcação 13C. © 2004 Wiley Periodicals, Inc.

 

Navrátil, M., Cimander, C., Mandenius, C.-F.
"On-line Multisensor Monitoring of Yogurt and Filmjölk Fermentations on Production Scale"
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (3), pp. 415-420. (2004)

Resumo

Os dados de espectroscopia no infravermelho próximo (IVP) e nariz eletrônico (NE) foram utilizados para o monitoramento on-line de fermentações de iogurte e filmjölk (leite coalho sueco) em condições industriais. Os sinais de IVP e NE foram selecionados por avaliação dos vetores de carga de análise de componentes principais e analisados posteriormente, estudando-se a variabilidade dos componentes principais selecionados. Os primeiros componentes principais para os sinais de IVP e NE foram utilizados para a geração on-line de um gráfico de trajetória do processo visualizando o estado real da fermentação. Os sinais de IVP também foram utilizados para estabelecer modelos empíricos de mínimos quadrados parciais (MQP) para previsão do pH das culturas e da acidez titulável (expressa em graus Thorner, oT). Ao usar cinco ou seis fatores MQP, os modelos produziram previsões aceitáveis que poderiam ser melhoradas ao aumentar o número de dados de calibração confiáveis e precisos. Os resultados apresentados demonstram que a fusão dos sinais de IVP e NE tem potencial para monitoramento on-line rápido e avaliação da qualidade do processo de fermentação do iogurte.

 

Gabig-Ciminska, M., Holmgren, A., Andresen, H., Bundvig Barken, K., Wümpelmann, M., Albers, J., Hintsche, R., Breitenstein, A., Neubauer, P., Los, M., Czyz, A., Wegrzyn, G., Silfversparre, G., Jürgen, B., Schweder, T., Enfors, S.-O.
"Electric chips for rapid detection and quantification of nucleic acids"
Biosensors and Bioelectronics, 19 (6), pp. 537-546. (2004)

Resumo

Um detector elétrico baseado em chip de silício acoplado à hibridização sanduíche com base em esferas (BBSH, na sua sigla em inglês) é apresentado como uma abordagem para realizar uma análise rápida de ácidos nucleicos específicos. Uma plataforma microfluídica que incorpora esferas paramagnéticas com sondas de captura imobilizadas é usada para as etapas de biorrecognição. O protocolo envolve a hibridização sanduíche simultânea de um alvo de ácido nucleico de cadeia simples com a sonda de captura nas esferas e com uma sonda de detecção na solução de reação, seguida da marcação enzimática da sonda de detecção, reação enzimática e, finalmente, medição potenciométrica do produto enzimático na superfície do chip. O anticorpo anti-DIG conjugado à fosfatase alcalina foi utilizado para a marcação enzimática da sonda de detecção marcada com DIG. O fosfato de p-aminofenol (pAPP) foi utilizado como substrato. O produto da reação enzimática, p-aminofenol (pAP), é oxidado no ânodo do chip para a quinoneimina que é reduzido de volta ao pAP no cátodo. A oxidação cíclica e a redução destes compostos resultam em uma corrente que produz um sinal característico que pode estar relacionado à concentração do analito. A realização das diferentes etapas no ensaio foi caracterizada utilizando-se oligonucleotídeos de RNA sintetizados in vitro e, em seguida, o instrumento foi utilizado para análise do 16S rRNA no extrato de Escherichia coli. O tempo do ensaio depende da sensibilidade necessária. O alvo de RNA artificial e o 16S rRNA, em quantidades que variam de 1011 a 1010 moléculas, foram testados em 25 min e 4 horas, respectivamente. © 2003 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Barken, K.B., Gabig-Ciminska, M., Holmgren, A., Molin, S.
"Effect of unlabeled helper probes on detection of an RNA target by bead-based sandwich hybridization"
BioTechniques, 36 (1), pp. 124-132. (2004)

Resumo

Os oligonucleotídeos auxiliares não marcados que ajudam em um ensaio de hibridização sanduíche baseada em esferas foram testados quanto à colocação ideal das sondas de captura e detecção. O alvo utilizado foi uma molécula completa de mRNA sintetizada in vitro. As sondas auxiliares complementares para as regiões adjacentes ao local de ligação da sonda de captura com extremidade anexada de 5' foram consideradas muito mais eficazes do que as sondas auxiliares que visam posições adjacentes ao local de ligação da sonda de detecção. Acredita-se que a diferença seja causada por uma ruptura da estrutura secundária do RNA na área em que a sonda de captura se liga, reduzindo assim a interferência estrutural da esfera. O uso de auxiliares adicionais demonstrou um efeito aditivo. O uso de auxiliares em ambos os lados das sondas de captura e detecção demonstrou um aumento de 15 a 40 vezes na eficiência de hibridização dependendo do alvo, aumentando assim a sensibilidade dos ensaios de hibridização. Utilizando um chip elétrico ligado à sonda de detecção para detectar p-aminofenol, que é produzido por fosfatase alcalina, atingiu-se um limite de detecção de moléculas de mRNA de 2 × 10–13 M sem o uso de uma etapa de amplificação de ácido nucleico.