Schneider T, Kruse T, Wimmer R, Wiedemann I, Sass V, Pag U, Jansen A, Nielsen AK, Mygind PH, Raventós DS, Neve S, Ravn B, Bonvin AM, De Maria L, Andersen AS, Gammelgaard LK, Sahl HG, Kristensen HH.
"Plectasin, a fungal defensin, targets the bacterial cell wall precursor Lipid II"
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June 2010

Pharmaceutical Microbiology Section, Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Parasitology, University of Bonn, D-53115 Bonn, Germany.

Resumo

Os peptídeos de defesa hospedeiros, como as defensinas, são componentes da imunidade inata e apresentam atividade antibiótica retida durante a evolução. Presume-se que sua atividade se deva às estruturas anfipáticas, que permitem a ligação e a ruptura das membranas citoplasmáticas microbianas. Ao contrário disso, mostramos que o plectasin, uma defensina fúngica, age ligando diretamente o lipídio II precursor da parede celular bacteriana. Uma ampla variedade de abordagens genéticas e bioquímicas identificam a biossíntese da parede celular como a via alvo do plectasin. Os testes in vitro para síntese da parede celular identificaram o lipídio II como o alvo celular específico. Consistentemente, os estudos de ligação confirmaram a formação de um complexo estequiométrico equimolar entre o lipídio II e o plectasin. Além disso, relevantes resíduos no plectasin envolvidos na formação complexa foram identificados usando modelagem computacional e espectroscopia de ressonância magnética nuclear.

PMID: 20508130 [PubMed – em processo]

 

Thomas Kruse Bjarke Christensen Dorotea Ravento´s, Allan K. Nielsen Jesper D. Nielsen, Natasa Vukmirovic, Hans-Henrik Kristensen.
"Transcriptional Profile of Escherichia coli in Response to Novispirin G10"
26 September 2008

Resumo

Usando uma nova metodologia, investigamos a resposta transcricional do Escherichia coli ao novispirin G10, um peptídeo antimicrobiano catiônico α-helicoidal. Mostramos que o novispirin G10 induz uma resposta transcricional excepcionalmente coerente no E. coli, resultando na regulação ascendente dos genes envolvidos na resposta ao estresse osmótico, choque ácido, choque de fago e peptídeos antimicrobianos, e regulação própria dos genes de resposta ao choque térmico, por exemplo, dnaJK, GroES e GroEL. Esse padrão transcricional indica que o novispirin G10 age comprometendo a membrana bacteriana e possivelmente também visando a resposta ao choque térmico. O impacto do novispirin G10 nas células do E. coli foi monitorado diretamente usando o teste fluorescente LIVE/DEAD, confirmando que o peptídeo realmente visa as membranas bacterianas. Além disso, de acordo com o que observamos na resposta transcricional do choque térmico, mostramos que a supraexpressão do fator de transcrição do choque térmico do E. coli, σ 32, leva a um aumento significativo na sensibilidade ao novispirin G10.

 

Thevissen, K., Kristensen, H.-H., Thomma, B.P.H.J., Cammue, B.P.A., François, I.E.J.A.
"Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins"
Drug Discovery Today, 12 (21-22), pp. 966-971. (2007)

Resumo

Para defenderem-se contra a invasão de patógenos fúngicos, as plantas e os insetos dependem em grande parte da produção de uma ampla variedade de moléculas antifúngicas, incluindo peptídeos antimicrobianos, como as defensinas. Curiosamente, as defensinas de plantas e insetos exibem atividade antimicrobiana não apenas contra os patógenos de plantas e insetos, mas também contra os patógenos fúngicos humanos, inclusive Candida spp. e Aspergillus spp. O foco desta revisão são essas defensinas, que são novas nas terapêuticas antifúngicas. Seu modo de ação, envolvendo a interação com esfingolipídios específicos de fungo, e expressão heteróloga, exigida para produção econômica, são importantes ativos para o desenvolvimento de defensinas de plantas e insetos como ligações antifúngicas. Os estudos que avaliam sua eficácia antifúngica in vivo demonstram seu potencial terapêutico. © 2007 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

 

Jacobsen, F., Mohammadi-Tabrisi, A., Hirsch, T., Mittler, D., Mygind, P.H., Sonksen, C.P., Raventos, D., Kristensen, H.H., Gatermann, S., Lehnhardt, M., Daigeler, A., Steinau, H.U., Steinstraesser, L.
"Antimicrobial activity of the recombinant designer host defence peptide P-novispirin G10 in infected full-thickness wounds of porcine skin"
Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 59 (3), pp. 493-498. (2007)

Resumo

Objetivos: o crescente número de pacientes com cicatrização deficiente de feridas e o desenvolvimento de bactérias resistentes a vários medicamentos exigem a investigação de alternativas no tratamento de feridas. A atividade antimicrobiana de peptídeos de defesa hospedeiros que ocorrem naturalmente e seus derivados podem ser uma alternativa para as opções terapêuticas existentes para o tratamento tópico de infecções em ferimentos. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar a atividade antimicrobiana da prolina-novispirin G10 (P-novispirin G10) in vitro e no modelo de câmara de titânio para estudo de ferimentos infectados em suínos. Métodos: o novo criador derivado do peptídeo de defesa hospedeiro da P-novispirin G10 foi testado in vitro contra cepas bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas. Além disso, a citotoxicidade e as atividades hemolíticas da P-novispirin G10 e protegrina-1 foram medidas. Para os estudos in vivo, seis câmaras para estudo de ferimentos foram implantadas em cada flanco dos miniporcos Göttinger (n = 2, fêmeas, 6 meses, 15–20 kg). Onze câmaras para estudo de ferimentos foram inoculadas 8 dias pós-operação com 5 × 108 Staphylococcus aureus; uma câmara permaneceu sem infecção como um controle de sistema. Após a infecção do ferimento ter sido estabelecida (4 dias depois da inoculação), cada câmara para estudo de ferimentos foi tratada de forma tópica com P-novispirin G10, protegrina-1 ou controle do portador. O fluido do ferimento foi colhido de hora em hora durante 3 horas. Resultados: a P-novispirin G10 demonstrou atividade antimicrobiana de aspecto amplo com atividades hemolíticas e citotóxicas moderadas em comparação com a protegrina-1. No modelo de câmara para tratamento de infecções infectado, a P-novispirin G10 demonstrou uma redução de 4 log10 nas contagens bacterianas. Conclusões: isso implica o potencial da P-novispirin G10 como uma alternativa no futuro tratamento de ferimentos antimicrobianos. Porém, mais estudos são necessários para definir em maiores detalhes as aplicações e os potenciais efeitos colaterais. © The Author 2007. Publicado pela Oxford University Press em nome da Sociedade Britânica de Quimioterapia Antimicrobiana. Todos os direitos reservados.

Taboureau, O., Olsen, O.H., Nielsen, J.D., Raventos, D., Mygind, P.H., Kristensen, H.-H.
"Design of novispirin antimicrobial peptides by quantitative structure-activity relationship"
Chemical Biology and Drug Design, 68 (1), pp. 48-57. (2006)

Resumo

O novispirin G10 é um peptídeo antimicrobiano α-helicoidal projetado em um esforço para desenvolver tratamentos alternativos contra microrganismos resistentes a vários medicamentos. Para otimizar ainda mais a atividade antimicrobiana, 58 análogos do novispirin foram construídos e usados para estabelecer um modelo de relação quantitativa com a atividade da estrutura. Um modelo estatisticamente significativo (r2 = 0,73, q2 = 0,61) foi obtido usando um conjunto de 69 descritores moleculares selecionados. Entre eles, o VolSurf e os descritores da área de superfície parcial carregados tiveram um papel dominante. A análise do modelo indicou que a hidrofobicidade, anfipaticidade e carga foram as características mais importantes que influenciaram a atividade deste conjunto de peptídeos. Além disso, a capacidade do modelo de relação quantitativa da atividade da estrutura para prever a bioatividade foi avaliada por meio da análise de um conjunto de 400 análogos do novispirin desenvolvidos pela modelagem molecular. Desses 400, 16 novos novispirins com uma atividade microbiana prevista mais alta foram testados no sistema de expressão suicida, e aproximadamente três de quatro pareceram mais potentes do que o novispirin G10 parental. A combinação do VolSurf e dos descritores da área de superfície parcial carregada parece relevante para mostrar a interação entre o novispirin e seu(s) alvo(s), supostamente a membrana celular microbiana. As descobertas apresentadas mostram que os métodos de relação da atividade da estrutura quantitativa e modelagem podem ser úteis na construção e/ou otimização da bioatividade dos peptídeos antimicrobianos para o desenvolvimento ainda maior como terapêuticos antibióticos eficazes. © 2006 The Authors.

 

Wimmer, R., Andersen, K.K., Vad, B., Davidsen, M., Mølgaard, S., Nesgaard, L.W., Kristensen, H.H., Otzen, D.E.
"Versatile interactions of the antimicrobial peptide novispirin with detergents and lipids"
Biochemistry, 45 (2), pp. 481-497. (2006)

Resumo

O novispirin G-10 é um peptídeo catiônico desenvolvido com 18 resíduos derivados da parte N-terminal de um peptídeo antimicrobiano da ovelha. Esse derivado é mais específico para bactéria do que o peptídeo parental. Analisamos as interações do novispirin com várias moléculas anfipáticas e descobrimos que uma variedade notavelmente ampla de condições induzem a estrutura α-helicoidal. A indução da estrutura ideal por lipídios ocorre quando as vesículas contêm 40–80% de lipídio aniônico, enquanto as vesículas de lipídio aniônico puro induzem a agregação. O SDS também forma agregados com o novispirin em concentrações submicelares, mas induzem as estruturas α-helicoidais acima da CMC. Os dois tipos de agregados contêm quantidades significativas da estrutura da folha β, destacando a versatilidade da estrutura do peptídeo. O detergente catiônico LTAC tem uma afinidade relativamente forte com o peptídeo catiônico, apesar da carga positiva bruta do peptídeo de +7 no pH fisiológico e a falta total de cadeias laterais carregadas negativamente. Os detergentes zwiteriônicos e aniônicos induzem estruturas α-helicoidais em várias centenas de detergentes milimolares. Solucionamos a estrutura do peptídeo no SDS e LTAB por RMN e encontramos diferenças sutis em comparação à estrutura do TFE, que atribuímos à interação com um ambiente anfifílico. O novispirin está abundantemente enterrado na micela do SDS, enquanto não entra na micela do LTAC, mas somente forma um equilíbrio dinâmico entre o novispirin ligado ou não ligado à superfície. Assim, a repulsão eletrostática pode ser anulada por concentrações relativamente altas de detergente ou pela desprotonação de uma única cadeia lateral crítica, embora a capacidade do novospirin de ligar-se a anfifílicos e formar estrutura α-helicoidal seja sensível à eletrostática do ambiente anfifílico. Isso enfatiza a versatilidade das interações dos peptídeos antimicrobianos catiônicos com anfifílicos. © 2006 American Chemical Society.

 

Mygind, P.H., Fischer, R.L., Schnorr, K.M., Hansen, M.T., Sönksen, C.P., Ludvigsen, S., Raventós, D., Buskov, S., Christensen, B., De Maria, L., Taboureau, O., Yaver, D., Elvig-Jørgensen, S.G., Sørensen, M.V., Christensen, B.E., Kjærulff, S., Frimodt-Moller, N., Lehrer, R.I., Zasloff, M., Kristensen, H.-H.
"Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus"
Nature, 437 (7061), pp. 975-980. (2005)

Resumo

Os animais e as plantas mais altas expressam antibióticos de peptídeo endogênico chamados defensinas. Esses pequenos peptídeos ricos em cisteína são ativos contra bactérias, fungos e vírus. Descrevemos aqui o plectasin, a primeira defensina a ser isolada de um fungo, o ascomiceto saprófita Pseudoplectania nigrella. O plectasin tem estruturas primária, secundária e terciária que são muito semelhantes às das defensinas encontradas em aranhas, escorpiões, libélulas e mexilhões. O plectasin recombinante foi produzido com um rendimento e pureza muito altos e comercialmente viáveis. In vitro, o peptídeo recombinante estava especialmente ativo contra o Streptococcus pneumoniae, incluindo as cepas resistentes aos antibióticos convencionais. O plectasin mostrou toxicidade extremamente baixa em ratos e os curou de peritonite e pneumonia experimentais causadas pelo S. pneumoniae de forma tão eficaz quanto a vancomicina e a penicilina. Essas descobertas identificam os fungos como uma nova fonte de defensinas antimicrobianas e mostram o potencial terapêutico do plectasin. Elas também sugerem que as defensinas de insetos, moluscos e fungos são decorrentes de um gene ancestral comum. © 2005 Nature Publishing Group.

 

Song, Z., Wu, H., Mygind, P., Raventos, D., Sonksen, G., Kristensen, H.-H., Høiby, N.
"Effects of intratracheal administration of novispirin G10 on a rat model of mucoid Pseudomonas aeruginosa lung infection"
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49 (9), pp. 3868-3874. (2005)

Resumo

A infecção pulmonar crônica por Pseudomonas aeruginosa é um grande problema para pacientes com fibrose cística (FC). O modo biofilme de crescimento do patógeno o torna altamente resistente ao tratamento antibiótico, e isso é especialmente acentuado com cepas mucoides. Neste estudo, o novispirin G10, um peptídeo antimicrobiano sintético padronizado livremente em 29 peptídeos antimicrobianos mieloides de ovelha, foi testado em um rato com infecção pulmonar mucoide pelo P. aeruginosa. O P. aeruginosa NH57388A, uma cepa mucoide isolada de um paciente com FC, foi misturado com o alginato produzido pela própria bactéria e ajustado a uma concentração de 1.010 UFC/ml. Cada rato recebeu 109 UFC da bactéria de forma intratraqueal no pulmão esquerdo para estabelecer a infecção pulmonar. Em 0 e 3 horas após a infecção por P. aeruginosa, o grupo tratado de ratos recebeu novispirin G10 (0,1 mg/ml, 0,1 ml/rato) por meio intratraqueal, enquanto que o grupo de controle recebeu somente tratamento instrumental. Os animais foram sacrificados nos dias 3, 5, 7 e 10 após o desafio para avaliação de vários parâmetros. No dia 5, 50% dos ratos do grupo tratado eliminaram a bactéria dos pulmões, enquanto que no grupo de controle, nenhum dos ratos eliminou o patógeno (P < 0,03). As cargas bacterianas médias restantes nos pulmões dos ratos tratados nos dias 3 e 5 foram mais de 170 e 330 vezes menor do que as dos grupos de controle (P < 0,0005 e P < 0,0003). Conforme previsto, a patologia macroscópica e microscópica do pulmão também foi significativamente mais suave no grupo tratado do que no grupo de controle (P < 0,0002). As respostas da citocina do pulmão no grupo tratado foram significativamente mais baixas do que as do grupo de controle. Os resultados sugeriram que o novispirin G10 pode ser útil no tratamento de infecções pulmonares do P. aeruginosa resistente a antibióticos. Copyright © 2005, American Society for Microbiology. Todos os direitos reservados.

 

Raventós, D., Taboureau, O., Mygind, P.H., Nielsen, J.D., Sonksen, C.P., Kristensen, H.-H.
"Improving on nature's defenses: Optimization & high throughput screening of antimicrobial peptides"
Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening, 8 (3), pp. 219-233. (2005)

Resumo

Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) estão onipresentes na natureza, onde desempenham funções importantes na defesa de hospedeiros e controle microbiano. Apesar da sua origem, potência e espectro antimicrobianos naturais, os candidatos a peptídeos líderes que até o momento entraram no desenvolvimento farmacêutico foram todos ainda mais otimizados por abordagens racionais e semirracionais. Nos últimos anos, vários sistemas de rastreio de alto rendimento (HTS, em sua sigla em inglês) foram desenvolvidos para abordar especificamente a otimização de PAMs. Isso inclui uma variedade de sistemas computacionais em ambientes virtuais e sistemas in vivo baseados em célula. Esses sistemas de rastreio baseados em ambiente virtual englobam vários métodos computacionais, como Relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR, em sua sigla em inglês), bem como métodos de simulação que imitam as interações entre peptídeos/membrana. Os sistemas baseados em in vivo podem ser divididos em sistemas de rastreio cis e trans. As pré-triagens de exatidão, em que a PAM exerce seus efeitos antimicrobianos na célula de produção, permitem a triagem de milhões de candidatos líderes para a atividade básica de perturbação de membrana e antimicrobiana. As triagens trans, em que a PAM é secretada ou ativamente liberada da célula de produção e interações com células diferentes da célula de produção, permitem a triagem em condições relevantes à aplicação e mais complexas. Esta revisão descreve a aplicação dos sistemas HTS utilizados para PAMs e lista as vantagens, bem como as limitações desses sistemas. © 2005 Bentham Science Publishers Ltd.

 

Ezra, D., Castillo, U.F., Strobel, G.A., Hess, W.M., Porter, H., Jensen, J.B., Condron, M.A.M., Teplow, D.B., Sears, J., Maranta, M., Hunter, M., Weber, B., Yaver, D.
"Coronamycins, peptide antibiotics produced by a verticillate Streptomyces sp. (MSU-2110) endophytic on Monstera sp"
Microbiology, 150 (4), pp. 785-793. (2004)

Resumo

Coronamycin é um complexo de novos antibióticos peptídeos com atividade contra os fungos pythiaceous e o patógeno fúngico humano Cryptococcus neoformans. Ele também é ativo contra o parasita da malária, Plasmodium falciparum, com um IC50 de 9,0 ng ml-1. O Coronamycin é produzido por uma espiral do Streptomyces sp. isolado como um endófito de um cipó epífito, o Monstera sp., encontrado na região de Manu no alto Amazonas do Peru. O fracionamento orientado por bioteste dos caldos de fermentação deste endófito em gel de sílica e a Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (CLAD) produziram dois peptídeos principais e inseparáveis com massas de 1.217,9 e 1.203,8 Da. Três outros menores, mas com componentes relacionados, também estão presentes na preparação. A análise do aminoácido do coronamycin revelou resíduos do componente 1, componente 2, metionina, tirosina e leucina em uma proporção de 2: 2: 1: 1: 3. Outros compostos com atividades antifúngicas também são produzidos por esse estreptomiceto endofítico. © 2004 SGM.

 

Per H. Mygind, Rikke L. Fischer, Kirk M. Schnorr, Mogens T. Hansen, Carsten P. S"nksen, Svend Ludvigsen, Dorotea Raventøs, Steen Buskov, Bjarke Christensen, Leonardo De Maria, Olivier Taboureau, Debbie Yaver, Signe G. Elvig-Jørgensen, Marianne V. Sørensen, Bjørn E. Christensen, Søren Kjærulff, Niels Frimodt-Moller, Robert I. Lehrer, Michael Zasloff and Hans-Henrik Kristensen.
"Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus."
Nature 437, 975-980 (13 October 2005)

Resumo

Animais e plantas mais altas expressam antibióticos peptídeos endogênicos chamados defensinas. Esses pequenos peptídeos ricos em cisteína são ativos contra bactérias, fungos e vírus. Descrevemos aqui o plectasin, a primeira defensina a ser isolada de um fungo, o ascomiceto saprófita Pseudoplectania nigrella. O plectasin tem estruturas primária, secundária e terciária que são muito semelhantes às das defensinas encontradas em aranhas, escorpiões, libélulas e mexilhões. O plectasin recombinante foi produzido com um rendimento e pureza muito altos e comercialmente viáveis. In vitro, o peptídeo recombinante estava especialmente ativo contra o Streptococcus pneumoniae, incluindo as cepas resistentes aos antibióticos convencionais. O plectasin mostrou toxicidade extremamente baixa em ratos e os curou de peritonite e pneumonia experimentais causadas pelo S. pneumoniae de forma tão eficaz quanto a vancomicina e a penicilina. Essas descobertas identificam os fungos como uma nova fonte de defensinas antimicrobianas e mostram o potencial terapêutico do plectasin. Elas também sugerem que as defensinas de insetos, moluscos e fungos são decorrentes de um gene ancestral comum.

 

Song ZJ, Wu H, Mygind P, Raventos D, Sonksen C, Kristensen HH, Hoiby N.
"Effects of intratracheal administration of novispirin G10 on a rat model of mucoid Pseudomonas aeruginosa lung infection."
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 49 (9) pp. 3868-3874 (2005)

Resumo

A infecção pulmonar crônica por Pseudomonas aeruginosa é um grande problema para pacientes com fibrose cística (FC). O modo biofilme de crescimento do patógeno o torna altamente resistente ao tratamento antibiótico, e isso é especialmente acentuado com cepas mucoides. Neste estudo, o novispirin G10, um peptídeo antimicrobiano sintético padronizado livremente em 29 peptídeos antimicrobianos mieloides de ovelha, foi testado em um rato com infecção pulmonar mucoide pelo P. aeruginosa. O P. aeruginosa NH57388A, uma cepa mucoide isolada de um paciente com FC, foi misturado com o alginato produzido pela própria bactéria e ajustado a uma concentração de 10(10) UFC/ml. Cada rato recebeu 10(9) UFC da bactéria de forma intratraqueal no pulmão esquerdo para estabelecer a infecção pulmonar. Em 0 e 3 horas após a infecção por P. aeruginosa, o grupo tratado de ratos recebeu novispirin G10 (0,1 mg/ml, 0,1 ml/rato) por meio intratraqueal, enquanto que o grupo de controle recebeu somente tratamento instrumental. Os animais foram sacrificados nos dias 3, 5, 7 e 10 após o desafio para avaliação de vários parâmetros. No dia 5, 50% dos ratos do grupo tratado eliminaram a bactéria dos pulmões, enquanto que no grupo de controle, nenhum dos ratos eliminou o patógeno (P < 0,03). As cargas bacterianas médias restantes nos pulmões dos ratos tratados nos dias 3 e 5 foram mais de 170 e 330 vezes menor do que as dos grupos de controle (P < 0,0005 e P < 0,0003). Conforme previsto, a patologia macroscópica e microscópica do pulmão também foi significativamente mais suave no grupo tratado do que no grupo de controle (P < 0,0002). As respostas da citocina do pulmão no grupo tratado foram significativamente mais baixas do que as do grupo de controle. Os resultados sugeriram que o novispirin G10 pode ser útil no tratamento de infecções pulmonares do P. aeruginosa resistente a antibióticos.

 

Raventos D, Taboureau O, Mygind PH, Nielsen JD, Sonksen CP, Kristensen HH.
"Improving on nature's defenses: Optimization & high throughput screening of antimicrobial peptides."
Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening, Vol. 8 (3) pp. 219-233 (2005)

Resumo

Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) estão onipresentes na natureza, onde desempenham funções importantes na defesa de hospedeiros e controle microbiano. Apesar da sua origem, potência e espectro antimicrobianos naturais, os candidatos a peptídeos líderes que até o momento entraram no desenvolvimento farmacêutico foram todos ainda mais otimizados por abordagens racionais e semirracionais. Nos últimos anos, vários sistemas de rastreio de alto rendimento (HTS, em sua sigla em inglês) foram desenvolvidos para abordar especificamente a otimização de PAMs. Isso inclui uma variedade de sistemas computacionais em ambientes virtuais e sistemas in vivo baseados em célula. Esses sistemas de rastreio baseados em ambiente virtual englobam vários métodos computacionais, como Relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR, em sua sigla em inglês), bem como métodos de simulação que imitam as interações entre peptídeos/membrana. Os sistemas baseados em in vivo podem ser divididos em sistemas de rastreio cis e trans. As pré-triagens de atuação cis, em que a PAM exerce seus efeitos antimicrobianos na célula de produção, permitem a triagem de milhões de candidatos líderes para a atividade básica de perturbação de membrana e antimicrobiana. As triagens trans, em que a PAM é secretada ou ativamente liberada da célula de produção e interações com células diferentes da célula de produção, permitem a triagem em condições relevantes à aplicação e mais complexas. Esta revisão descreve a aplicação dos sistemas HTS utilizados para PAMs e lista as vantagens, bem como as limitações desses sistemas.