Eijsink, V.G.H., GÅseidnes, S., Borchert, T.V., Van Den Burg, B.
"Directed evolution of enzyme stability"
Biomolecular Engineering, 22 (1-3), pp. 21-30. (2005) 

Resumo

O desenvolvimento de enzimas modernas depende cada vez mais de estratégias baseadas na geração de diversidade e da seleção de variantes com propriedades otimizadas. Em princípio, essas estratégias de evolução direcionadas podem ser usadas para otimizar qualquer propriedade enzimática, que pode ser rastreada de maneira economicamente viável, mesmo que não seja conhecida a base molecular dessa propriedade. A estabilidade é uma propriedade interessante das enzimas porque (1) é de grande importância industrial, (2) é relativamente fácil de pesquisar e (3) a base molecular da estabilidade relaciona-se estreitamente com questões contemporâneas na ciência proteica, como o problema de dobra proteica e doenças de dobra proteica. Logo, a engenharia da estabilidade enzimática é de interesse comercial e científico. Aqui, analisamos como a evolução direta contribuiu para o desenvolvimento de enzimas estáveis e para uma nova visão dos princípios da estabilidade proteica. Vários exemplos recentes são descritos. Esses exemplos demonstram que a evolução direcionada é uma estratégia efetiva para obter enzimas estáveis, especialmente quando usada em combinação com estratégias de engenharia racional ou semirracional. Em relação aos princípios da estabilidade proteica, algumas lições importantes a serem aprendidas com os esforços recentes na evolução direcionada são (1) há muitas formas estruturais para estabilizar uma proteína, que nem sempre é fácil de racionalizar, (2) as proteínas podem muito bem ser estabilizadas através da otimização de suas superfícies, e (3) essa alta estabilidade térmica pode ser obtida sem perda de desempenho catalítico a baixas temperaturas. © 2005 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

J.R Cherry; A.L. Fidantsef.
"Directed evolution of industrial enzymes: An update."
Curr Opin Biotechnol., 14(4), 438-43 (2003)

Resumo

O uso de enzimas em processos industriais costuma abolir o uso de altas temperaturas, solventes orgânicos e extremos de pH, além de oferecer maior especificidade da reação, pureza do produto e menor impacto ambiental. O uso crescente de enzimas industriais depende de inovação constante para melhorar o desempenho e reduzir os custos. Essa inovação é movida por um banco de dados que aumenta cada vez mais rápido da diversidade de enzimas naturais, DNA recombinante e tecnologias de fermentação que permitem a produção dessa diversidade a baixo custo, além de ferramentas de modificação de proteínas que permitem refinar as enzimas para adequação ao mercado industrial.

 

J.E. Ness; S. Kim; A. Gottman; R. Pak; A. Krebber; T.V. Borchert; S. Govindarajan; E.C. Miundorff; J. Minshull.
"Synthetic shuffling expands functional protein diversity by allowing amino acids to recombine independently".
Nature Biotechnology, 20, 1251-1255 (2002)

Resumo

Descrevemos o shuffling sintético, uma tecnologia evolucionária da engenharia de proteínas na qual todos os aminoácidos de um grupo de ascendentes podem recombinar-se independentemente de todos os demais aminoácidos. Com o uso de oligonucleotídeos degenerados, o shuffling sintético propicia um atalho direto das informações das sequências dos bancos de dados às bibliotecas funcionais. Os genes iniciais físicos não são necessários, e critérios adicionais de projeto, como uso ideal dos códons ou mutações benéficas conhecidas também, podem ser incorporados. Realizamos o shuffling sintético de 15 genes de subtilisina e obtivemos enzimas ativas e extremamente quiméricas, com combinações desejáveis de propriedades, que não conseguimos obter por meio de outros métodos de evolução dirigida.

 

S. Danielsen; M. Eklund: H-J. Deussen; T. GrSslund; P-Å. Nygren;T. V. Borchert.
"In vitro selection of enzymatically active lipase variants from phage libraries using a mechanism-based inhibitor".
Gene, 272, 267-274 (2001)

Resumo
A "lipase em detergente" Lipolase®, produzida pela Thermomyces lanuginosa, foi submetida a uma abordagem combinatória de engenharia de proteínas/exibição em fagos no intuito de identificar novas variantes de enzimas com características melhoradas na presença de detergentes. Primeiramente, demonstrou-se que é possível produzir Lipolase((R)) de tipo selvagem em Escherichia coli mantendo-se plena atividade e exibi-la como uma enzima ativa em fusão com a proteína de cobertura 3 no fago M13 de E. coli. Criou-se então uma biblioteca de fagomídeos que resultasse em aproximadamente duas ou três mutações por gene de lipase. Nove aminoácidos localizados em suas regiões próximas ao local de atividade foram destacados para randomização. Seleções feitas com um inibidor baseado num mecanismo biotinilado mostraram que os fagos que exibiam Lipolase® poderiam ser enriquecidos especificamente com uma população de fagos de controle. Seleções feitas no estoque de fogos de uma biblioteca na presença de um inibidor e um detergente em pó comercializado promoveram um aumento por etapas na proporção de clones ativos. A análise de 84 clones ativos revelou que todos expressavam atividade de lipase, porém inferior à de um clone produtor de Lipolase((R)) de tipo selvagem. Em seis dos sete clones mais ativos, uma serina de tipo selvagem na posição 83 fora substituída pela treonina, substituição notória por alterar a preferência de comprimento da cadeia do substrato de variantes da Lipolase®. Além disso, a seleção tinha variantes de enzimas enriquecidas com alto grau de conservadorismo em uma das regiões variegadas, o que sugere que essa região é importante para a atividade enzimática e que o procedimento designado para a seleção foi relevante. As variantes selecionadas continham principalmente resíduos de aminoácidos básicos na outra região variegada. Considerados em seu conjunto, os resultados descritos mostram que é possível elaborar protocolos de seleção baseados em atividade enzimática para essa classe de enzimas que tenham importância em futuras tentativas da engenharia de proteínas.