Jacobsen, J., Lydolph, M., Lange, L.
"Culture independent PCR: An alternative enzymes discovery strategy"
(2005) Journal of Microbiological Methods, 60 (1), pp. 63-71.

Resumo
Os primers degenerados foram projetados para uso em uma triagem de PCR independente da cultura de DNA a partir de comunidades fúngicas compostas, resíduos em habitação de folhas e palha de milho. De acordo com buscas e alinhamentos de similaridade, sequências clone ampliadas afiliadas com a família da glicosil hidrolase 7 e a família da glicosil hidrolase 45 por meio de divergência de sequência significativa foram observadas. As glicosil hidrolases das famílias 7 e 45 têm uma função fundamental na conversão da biomassa em combustível etanol. A pesquisa sobre essa fonte de energia renovável tem dois objetivos: (i) Contribuir para o desenvolvimento de uma alternativa renovável para as reservas limitadas de óleo fóssil bruto do mundo e (ii) reduzir a poluição do ar. A ampliação com primers específicos do rDNA 18S revelou a presença de espécies nas ordens dos ascomicetos Sordariales e Hypocreales, bem como na ordem do basidiomiceto Agaricales nessas comunidades. Nosso estudo documenta o valor da PCR independente de cultura em estudos de diversidade microbiana e poderia complementar o desenvolvimento de uma nova tecnologia de triagem de enzimas. © 2004 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados. 


Becker, F., Schnorr, K., Wilting, R., Tolstrup, N., Bendtsen, J.D., Olsen, P.B.
"Development of in vitro transposon assisted signal sequence trapping and its use in screening Bacillus halodurans C125 and Sulfolobus solfataricus P2 gene libraries"
(2004) Journal of Microbiological Methods, 57 (1), pp. 123-133.

Resumo
Para identificar as proteínas extracitosólicas de codificação de genes, um minitransposon, o TnSig, contendo um β-lactamase (′bla) sem sinal como o gene repórter, foi construído e usado para a transposição in vitro das bibliotecas genômicas feitas no Escherichia coli. O gene ′bla foi clonado em um minitransposon Mu bacteriófago, que permite as fusões translacionais entre os genes ′bla e alvo. A fusão do TnSig no quadro de leitura correto aos domínios de uma transmembrana de transporte de proteína ou peptídeos de sinal resultou na resistência à ampicilina do clone correspondente. As bibliotecas do gene procariota da bactéria alcalófila Bacillus halodurans C125 e da arquea hipertermofílica Sulfolobus solfataricus P2 foram marcadas com TnSig. As sequências genômicas, que estão disponíveis ao público (EMBL BA000004 e EMBL AE006641), foram usadas para a identificação e previsão do quadro de leitura aberta (QLA) da localização da proteína na célula. Os genes para proteínas secretadas, proteínas transmembrana e lipoproteínas foram identificadas com êxito por esse método. Em contraste ao transposon anterior baseado em estratégias de identificação, o método descrito aqui é rápido e versátil, e essencialmente permite que qualquer biblioteca compatível com marcador selecionável seja marcada. É adequada para identificar proteínas extracitosólicas de codificação nas bibliotecas de genes de uma ampla variedade de organismos procariotas. © 2004 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.


W. Helbert; H. Chanzy; T.L. Husum; M. Schülein; S. Ernst.
"Fluorescent cellulose microfibrils as substrate for the detection of cellulase activity".
Biomacromolecules, 4, 481-487 (2003)

Resumo
Para desenvolver um teste de celulase sensível baseado em substratos com a maioria das características físicas da celulose nativa, 5-(4,6-diclorotriazinil)aminofluoresceína (DTAF) foi usado como um agente de enxerto para preparar suspensões de microfibrilas fluorescentes da celulose bateriana. Essas suspensões foram digeridas por uma série de celulases comercialmente relevantes da origem do Humicola insolens: Cel6B e Cel 45A clonadas, bem como o complexo bruto do H. insolens. A digestão induziu a liberação de celodextrinas fluorescentes, bem como de açúcares redutores. Após a centrifugação adequada, esses produtos solúveis foram analisados como uma função de conteúdo de enxerto, tempo de digestão e características de celulase. Os dados resultantes permitiram otimizar as condições de enxerto para maximizar a quantidade de produtos solúveis e, portanto, aumentar a sensibilidade da detecção. Uma comparação entre a quantidade liberada de birrefringência e açúcar de redução permitiu diferenciar entre as atividades processuais exo e endo-celulase.  A fundição de filmes de microfibrilas enxertadas de DTAF na parte inferior de placas de titulação de micropoço também levaram à detecção da celulase sensível. Como esses filmes mantiveram a integridade e permaneceram firmemente colados à parte inferior do poço durante o tempo de digestão, eles são bastante adequados para uma automação completa do teste de celulases.


V. Boyer; S. Fort; T.P. Frandsen; M. Schulein; S. Cottaz; H. Driguez.
"Chemoenzymatic synthesis of a bifunctionalized cellohexaoside as a specific substrate for the sensitive assay of cellulase by fluorescence quenching"
Chemistry-a European Journal, 8 (6),1389-1394 (2002)

Resumo
Um novo derivado de celohexaose bifuncionalizada foi sintetizado como um substrato específico para o teste contínuo de celulases por transferência ressonante de energia. Esse celohexaósido tem uma fração naftaleno (EDANS) como um doador de energia fluorescente na extremidade de redução e um derivado 4-(4'- dimetilaminobenzeno)-benzeno como um cromóforo aceitante na extremidade de não redução. As principais etapas para a preparação da molécula alvo envolveram as reações transglicosilação dos doadores de fluoreto celobiose e celotetraosil nos aceitantes de celobiose catalisados pelo mutante E197A da celulase Cel7B do Humicola insolens. Na digestão com várias celulases, a transferência de energia foi interrompida e um aumento da fluorescência foi observado.


S.F. Lassen; J. Breinholt; P.R. Østergaard; R. Brugger; A. Bischoff; M. Wyss; C.C. Fuglsang.
"Expression, Gene Cloning, and Characterization of Five Novel Phytases from Four Basidiomycete Fungi: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, a Ceriporia sp., and Trametes pubescens."
Appl. Environ. Microbiol., 67, 4701-4707 (2001)

Resumo
As fitases catalisam a hidrólise de ligações phosphomonoester de fitato (mio-inositol hexaquisfosfato), criando assim formas mais inferiores de mio-inositol fosfatos e fosfatos inorgânicos. Neste estudo, as bibliotecas de expressão de cDNA foram construídas a partir de quatro fungos basidiomicetos (Peniophora lycii, Agrocybe pediades, um Ceriporia sp. e Trametes pubescens) e selecionadas por atividade de fitase em levedura. Um cDNA completo com codificação de fitase foi isolado de cada biblioteca, exceto da biblioteca do Ceriporia sp., onde dois cDNA de codificação de fitase diferentes foram encontrados. Todas as cinco fitases foram expressas no Aspergillus oryzae, purificadas e caracterizadas. As fitases revelaram a melhor temperatura entre 40 e 60 graus centígrados e o melhor pH em 5,0 a 6,0, exceto para a fitase do P. lycii, que tem o melhor pH em 4,0 a 5,0. Elas exibiram atividades específicas na faixa de 400 a 1,200 U mg, de proteína(-1) e foram capazes de baixar a hidrolisação do fifato para mioinositol monofosfato. Surpreendentemente, a análise por ressonância magnética nuclear H-1 da hidrólise do fitato pelas cinco fitases do basidiomiceto mostraram uma preferência para o ataque inicial no grupo 6-fosfato do ácido fítico, uma característica que, até então, acreditava-se não ter sido observada com fitases fúngicas. Consequentemente, as fitases do basidiomiceto descritas aqui devem ser agrupadas como 6-fitases (EC 3.1.3.26).


M. Skjøt; S. Kauppinen; L.V. Kofod; C.C.Fuglsang, M. Pauly; H. Dalbøge; L.N. Andersen.
"Functional cloning of an endo-arabinanase from Aspergillus aculeatus and its heterologous expression in A. oryzae and tobacco"
Mol. Genet. Genomics, 265, 913-921 (2001)

Resumo
A clonagem funcional em levedura tem sido usada para isolar cDNAs completos que codificam uma endo-alfa -1, 5-L-arabinanase do fungo filamentoso Aspergillus aculeatus. A triagem de uma biblioteca de cDNA construída em um vetor de expressão de levedura que hidrolisaram o AZCL-arabinano identificou 44 clones do Saccharomyces cerevisiae, todos abrigados no mesmo cDNA de codificação arabinanase. O cDNA clonado foi expresso no A. oryzae e a enzima recombinante foi purificada e caracterizada. O modo de ação da enzima foi estudado por meio da análise do padrão de digestão do arabinano desramificado. O perfil de digestão obtido sugere fortemente que a enzima é uma endo-arabinanase. Além disso, a viabilidade de usar o Nicotiana tabacum como um hospedeiro alternativo para a expressão arabinanase foi investigada.


M. Pauly; L.N. Andersen; S. Kauppinen; L.V. Kofod; W.S. York; P. Albersheim; A. Darvill.
"A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme".
Glycobiology, 9 (1), 93-100 (1999)

Resumo
Um c-DNA completo que codifica uma endo-beta-1, 4-glucanase específica do xiloglucano (XEG) foi isolado do fungo filamentoso Aspergillus aculeatus pela clonagem da expressão na levedura. As colônias que expressaram XEG funcional foram identificadas em placas de ágar contendo xiloglucano reticulado com corante azurina. O cDNA que codifica o XEG foi isolado, sequenciado, clonado no vetor de expressão do Aspergillus e transformado no Aspergillus oryzae para expressão heteróloga. A enzima recombinante foi purificada para homogeneidade aparente por permuta de aniões e cromatografia de gel em permeação. O XEG recombinante tem uma massa molecular de 23.600, um ponto isoelérico de 3,4, e é idealmente estável em um pH de 3,4 e temperatura abaixo de 30 ºC. A enzima hidrolisa estruturalmente diversos xiloglucanos de várias fontes, mas não hidrolisa nenhum outro componente da parede celular e pode, portanto, ser considerada uma endo-beta-1, 4-glucanase específica do xiloglucano. O XEG hidrolisa seus substratos com retenção da configuração anomérica. O Km da enzima recombinante é 3,6 mg/ml, e sua atividade específica é 260 micromol/min por mg de proteína. A enzima foi testada por sua estabilidade para solubilizar oligossacarídeos de xiloglucano das paredes celulares da planta. Foi mostrado que o tratamento das paredes celulares da planta com XEG produz somente oligossacarídeos de xiloglucano, indicando que essa enzima pode ser uma ferramenta poderosa na elucidação estrutural dos xiloglucanos.