Micheelsen, P.O., Østergaard, P.R., Lange, L., Skjøt, M.
"High-level expression of the native barley α-amylase/subtilisin inhibitor in Pichia pastoris"
Journal of Biotechnology, 133 (4), pp. 424-432. (2008)

Resumo

Desenvolveu-se um sistema para expressão de alto nível do inibidor de α-amilase/subtilisina de Hordeum vulgare (BASI) nativo em Pichia pastoris, usando o promotor da álcool oxidase 1 (AOX1) induzível por metanol. Para otimizar a expressão, duas regiões de codificação otimizadas por códons foram projetadas e expressas juntamente com a região de codificação selvagem. Para garantir a secreção da proteína nativa madura, usou-se uma versão truncada do sinal de secreção do fator de acoplamento alfa de Saccharomyces cerevisiae. Para a comparação dos níveis de expressão de diferentes clones, selecionaram-se transformantes de inserção única gerados por substituição de genes da AOX1 por triagem de PCR. Após a indução do metanol, os níveis de expressão atingiram 125 mg L-1 da região de codificação selvagem, enquanto a expressão das duas variantes otimizadas por códons atingiu 65 e 125 mg L-1, respectivamente. A proteína foi purificada e caracterizada por degradação de Edman, espectrometria de massa por cromatografia líquida e ensaio com amido azul insolúvel, e revelou-se possuidora das mesmas características que a proteína de tipo selvagem purificada de grãos de cevada. © 2007 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Hamann, T., Lange, L.
"Discovery, cloning and heterologous expression of secreted potato proteins reveal erroneous pre-mRNA splicing in Aspergillus oryzae"
Journal of Biotechnology, 126 (3), pp. 265-276. (2006)

Resumo

A nova tecnologia de sequestro de sinal assistido por transpósons (TAST, na sigla em inglês), desenvolvida para selecionar especificamente apenas proteínas secretadas, foi usada para descobrir novas proteínas vegetais extracelulares de Solarium tuberosum infectada com Phytophthora infestans. A análise de 384 resultados detectou 191 sequências de proteínas secretadas de P. infestans e S. tuberosum, sendo que aproximadamente 2/3 delas provinham da batata. Subsequentemente, procedeu-se à triagem dos genes interessantes com bioinformática. Apresenta-se uma seleção da variedade das sequências descobertas, inclusive uma nova xiloglucana endotransglicosilase de S. tuberosum (StXTH), que foi clonada e submetida a estudos detalhados de expressão heteróloga em Aspergillus oryzae. A análise de RT-PCR do mRNA de transformantes da StXTH1 de A. oryzae revelou que partes do pool do mRNA havia sido processada incorretamente e que apenas indicações fracas e inconsistentes de proteína ativa puderam ser detectadas. O alto conteúdo de proteína ativa da StXTH1 e a ocorrência de sítios de reconhecimento de pontos de ramificação, doadores e aceptores de íntrons de A. oryzae acarretou a interpretação errônea de íntrons (íntrons crípticos) de partes da sequência de codificação do mRNA. Isso talvez explique as dificuldades geralmente encontradas quando se tenta expressar genes de plantas em fungos filamentosos. © 2006 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Herzberg, K., Bashkirov, V.I., Rolfsmeier, M., Haghnazari, E., McDonald, W.H., Anderson, S., Bashkirova, E.V., Yates III, J.R., Heyer, W.-D.
"Phosphorylation of Rad55 on serines 2, 8, and 14 is required for efficient homologous recombination in the recovery of stalled replication forks"
Molecular and Cellular Biology, 26 (22), pp. 8396-8409. (2006)

Resumo

Os pontos de controle de danos ao DNA coordenam a reação celular ao estresse genotóxico e detêm o ciclo das células em resposta a esses danos e à paralisia da forquilha de replicação. A recombinação homóloga é uma via onipresente para reparo das rupturas da cadeia dupla do DNA e outras lesões induzidas pelos pontos de controle. Além disso, a recombinação homóloga está envolvida na tolerância pós-replicativa aos danos e na recuperação da replicação do DNA após a paralisia da forquilha de replicação. Aqui, mostramos que a fosforilação das serinas 2, 8 e 14 (S2,8,14) da proteína Rad55 é especificamente exigida para a sobrevivência e para o crescimento normal em caso de estresse genotóxico em todo o genoma. A Rad55 é paráloga da Rad51 em Saccharomyces cerevisiae e atua na montagem do filamento da Rad51, constituindo uma intermediária essencial no reparo recombinacional do DNA. Os mutantes da Rad55-S2,8,14A que têm falhas de fosforilação atravessam a fase S muito devagar sob condições de dano ao DNA, o que provavelmente se deve à recuperação mais lenta das forquilhas de replicação paralisadas ou à maior lentidão do reparo dos danos associados à replicação de DNA. Esses resultados sugerem que a fosforilação da Rad55-S2,8,14 ativa o reparo recombinacional, permitindo maior rapidez na recuperação após estresse genotóxico. Copyright © 2006, American Society for Microbiology. Todos os direitos reservados.

 

Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Stöger, E., Arcalis, E., Pontopidan, K., Holm, P.B.
"Heat-stable phytases in transgenic wheat (Triticum aestivum L.): Deposition pattern, thermostability, and phytate hydrolysis"
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (13), pp. 4624-4632. (2006)

Resumo

O presente artigo aborda a questão da termotolerância de enzimas heterólogas sintetizadas na planta tomando a fitase como modelo. Avaliaram-se dois materiais de trigo transgênico que expressam uma fitase de Aspergillus fumigatus de baixa temperatura de desnaturação (62,5 °C), mas alta capacidade de enovelamento, e uma fitase concebida consensual e racionalmente, projetada para apresentar alta temperatura de desnaturação (89,3 °C). O promotor 1DX5 da glutenina de alto peso molecular do trigo garantiu altos níveis de expressão específica de endosperma. A imunodetecção no microscópio de luz e no microscópio de elétrons mostra inequivocamente que a fitase heteróloga é depositada no vacúolo, embora os construtos da transformação tenham sido projetados para secreção no apoplasto. A avaliação das propriedades de estabilidade térmica e das propriedades cinéticas kinetic properties esclareceu que, sob essas condições de deposição, a estabilidade térmica baseada na alta temperatura de desdobramento é superior à capacidade de enovelamento e constitui uma estratégia realista para melhorar a biodisponibilidade de minerais e fosfatos em rações e alimentos à base de cereais. © 2006 American Chemical Society.

 

C. Muller; C. M. Hjort; K. Hansen; J. Nielsen.
"Altering the expression of two chitin synthase genes differentially affects the growth and morphology of Aspergillus oryzae."
Microbiology (Reading), 148 (12), 4025-4033 (2002)

Resumo

Identificaram-se em Aspergillus oryzae uma quitina sintase (chsB) completa e fragmentos de duas outras quitina sintases (csmA e chsC). A sequência de aminoácidos deduzida da chsB era semelhante (87% de identidade) à da chsB de Aspergillus nidulans, que codifica uma quitina sintase de classe III. A sequência obtida para a csmA indicou alta semelhança em relação às quitina sintases de classe V. As cepas disruptivas chsB e csmA e uma cepa na qual a transcrição da chsB foi controlada foram construídas usando o promotor da nitrito redutase (niiA). As cepas foram examinadas durante o crescimento de hifas pelo método Northern Blot e por análise da composição e crescimento da parede celular na presença do corante Calcofluor white (CFW). A cepa chsB que apresentava disrupção e a cepa não induzida p(niiA)-chsB demonstraram hiper-ramificação, tinham nível de conidiação mais baixo que o tipo selvagem e eram sensíveis ao CFW a 50 mg l(-1). Quando a transcrição da chsB na cepa que continha o construto p(niiA)-chsB foi induzida, esta apresentou morfologia de tipo selvagem em meio sólido e a taxas de crescimento abaixo da máxima, mas a morfologia de tipo selvagem não foi plenamente restaurada durante o crescimento rápido no cultivo em lote. A cepa csmA disruptiva apresentou anormalidades morfológicas como células balão, hifas no interior de hifas e cicatrizes conidiais. O crescimento foi seriamente inibido na presença de 10 mg CFW por litro(-1). Em nenhuma das cepas construídas, a composição da parede celular diferia da do tipo selvagem. O método Northern Blot não indicou nenhuma alteração na transcrição dos genes das quitina sintases csmA e chsC quando a expressão da chsB era alterada, e não houve nenhuma alteração na transcrição de chsB e chsC quando houve disrupção em csmA.

 

H. Pedersen; B. Christensen; C. Hjort; J. Nielsen.
"Construction and characterization of an oxalic acid nonproducing strain of Aspergillus niger."
Metab Eng, 2(1), 34-41 (2000)

Resumo

O ácido oxálico é um subproduto de Aspergillus niger que causa problemas com o processamento downstream de enzimas industriais. Para superá-los, o gene oah, que codifica a oxaloacetato hidrolase (EC 3.7.1.1), sofreu disrupção em uma cepa produtora de glucoamilase de A. niger. Com isso, a cepa resultante mostrou-se incapaz de produzir ácido oxálico. A cepa cujo gene sofreu disrupção foi comparada à do tipo selvagem, que produz ácido oxálico em cultivos em lote. A taxa de crescimento específico de ambas as cepas foi de 0,20 h (-1). Os rendimentos de ácido cítrico foram idênticos, mas o rendimento de glicoamilase foi apenas 50% no disruptivo em comparação à cepa do tipo selvagem. Experimentos de lote com glicose marcada com 13C como substrato foram realizados para determinar os fluxos metabólicos através do metabolismo central. As duas cepas apresentaram fluxos metabólicos quase idênticos, o que sugeriu que foi possível interromper o gene oah sem consequências pleiotrópicas. O fluxo através da via das pentoses-fosfato foi aproximadamente 60% da captação de glicose para ambas as cepas, o que sugeriu que um suprimento suficiente de NADPH estava disponível para a biossíntese.

 

P.L. Jørgense n; M. Tangney; P.E. Pedersen; S. Hastrup; B. Diderichsen; S.T. Jørgensen.
"Cloning and sequencing of an alkaline protease gene from Bacillus lentus and amplification of the gene on the B. lentus chromosome by an improved technique."
Appl. Environ. Microbiol. 66, 825-827 (2000)

Resumo

Um gene que codifica uma proteinase alcalina (subtilisina), conhecido comercialmente como Savinase®, foi clonado do Bacillus lentus NCF 10309 alcalófilo em B. subtilis DN497, e a sua sequência de nucleotídeos foi determinada. O gene clonado foi utilizado para aumentar o número de cópias do gene da proteinase no cromossomo. A partir desses estudos, uma técnica genética melhorada para a integração e a amplificação genética foi desenvolvida usando o plasmídeo pE194 termossensível.

 

K. L. Petersen; J Lehmbeck; T. Christensen.
"A new transcriptional activator for amylase genes in Aspergillus."
Mol Gen Genet, 262, 668-676 (1999)

Resumo

Nós clonamos um gene regulador para a síntese de amilase em Aspergillus oryzae. Este gene, amyR, codifica um ativador transcricional de 604 aminoácidos com um grupo de zinco Cys6 que exibe extensa homologia ao domínio de ligação ao DNA de GAL4 da Saccharomyces cerevisiae. O domínio de ligação ao DNA de amyR liga-se a dois tipos de sequências encontradas em vários promotores de genes de Aspergillus que codificam enzimas degradantes de amido. Um tipo de sítio de ligação é caracterizado por dois tripletos de CGG separados por oito nucleotídeos. O outro tipo tem apenas um tripleto de CGG, seguido pela sequência AAATTTAA.