Albaek, M.O., Gernaey, K. V., Hansen, M. S., Stocks, S. M
“Modeling Enzyme Production With Aspergillus oryzae in Pilot Scale Vessels With Different Agitation, Aeration, and Agitator Types”
Biotechnology and Bioengineering 108(8) pp 1828- 1840 (2011)

Resumo

O objetivo deste artigo é demonstrar como se pode criar um modelo que permita a previsão da evolução da fermentação fed-batch submersa de um fungo filamentoso com precisão aceitável. O processo estudado foi a produção de enzimas com Aspergillus oryzae em reatores de 550 litros agitados em planta piloto. Foram empregadas diferentes condições de agitação e aeração, bem como duas diferentes geometrias de impulsor. O fator de limitação da produtividade foi o suprimento de oxigênio do caldo de fermentação, e o controle da taxa do fluxo de alimentação do substrato de carbono foi a tensão do oxigênio dissolvido. Para prever a transferência do oxigênio disponível no sistema, determinou-se primeiro a estequiometria da equação da reação, inclusive para o consumo do substrato de manutenção. Com base principalmente na concentração da biomassa, criou-se um modelo de previsão da viscosidade, já que o aumento da viscosidade do caldo de fermentação devido ao crescimento das hifas do fungo provoca uma transferência de massa consideravelmente inferior perto do fim do processo de fermentação. Mostrou-se que cada compartimento do modelo previa bem os resultados experimentais. No geral, o modelo pode ser usado para prever parâmetros essenciais do processo em condições variáveis de fermentação.


Albaek, M.O., Gernaey, K. V., Stocks, S.
"Gassed and ungassed power draw in a pilot scale 550 litre fermentor retrofitted with up-pumping hydrofoil B2 impellers in media of different viscosity and with very high power draw”
Chemical Engineering Science 63 (24) pp. 5813 – 5820 (2008)

Resumo

Inúmeros impulsores modernos foram concebidos no intuito de obter uma alternativa à tradicional turbina de Rushton, que apresenta várias deficiências reconhecidas. Uma combinação de bombeamento para cima composta de dois Hayward Tyler B2 (antigo APV-B2 ou simplesmente B2), impulsores a hidrofólio de alta taxa de solidez, foi readaptada com métodos tradicionais para fermentadores em escala piloto com base nos estudos de referência citados do desempenho do impulsor. Usando água como meio e trações de potência comparativamente baixa, o impulsor B2 já demonstrou anteriormente ter boas propriedades no manejo de gás e baixo número de potência sem gás, o que permite seu uso com diâmetros de alta proporção impulsor/tanque. No presente estudo, procedeu-se a uma caracterização da potência do impulsor B2, a fim de estender os dados disponíveis a meios viscosos semelhantes a caldos de fermentação e a trações de potências muito altas. Caracterizações da potência foram levadas a cabo com taxas de entrada de energia específicas de até 12,9 kW/m3 usando diferentes meios de descompactação por cisalhamento.
Determinou-se o número de potência sem gás do impulsor B2 (3,3 em trações na faixa 0–11,6 kW/m3), e nossos achados confirmam os de estudos anteriores e estendem as tendências a meios de alta viscosidade. Na aeração, os impulsores B2 perdem pouca potência se comparados aos impulsores tradicionais, mesmo quando se aplica tração de potência muito alta (perda de potência de 10 a 20% a 450 rpm e 1,28 vvm, o que corresponde a 11,6 kW/m3). Descobriu-se que as flutuações do torque do impulsor em questão são pequenas (<5%) a trações de potência muito altas e meios de alta viscosidade. Por fim, demonstrou-se que o impulsor B2 pode ser readaptado com métodos tradicionais para fermentadores em escala piloto com alto grau de segurança.


Petersen, N., Stocks, S., Gernaey, K.V.
"Multivariate models for prediction of rheological characteristics of filamentous fermentation broth from the size distribution"
Biotechnology and Bioengineering, 100 (1), pp. 61-71. (2008)

Resumo

O objetivo deste artigo é demonstrar que é possível usar análise de componentes principais (PCA, na sigla em inglês) e regressão por mínimos quadrados parciais (PLSR, também na sigla em inglês) para extrair informações de dados da distribuição do tamanho das partículas e prever propriedades reológicas. Amostras de fermentações de Aspergillus oryzae comercialmente relevantes conduzidas em tanques de 550 litros em escala piloto foram caracterizadas no que respeita à distribuição do tamanho das partículas, à concentração da biomassa e às propriedades reológicas. As propriedades reológicas foram descritas usando o modelo de Herschel-Bulkley. A estimativa de todos os três parâmetros do modelo de Herschel-Bulkley (tensão de cedência (τy), índice de consistência (K) e índice de comportamento do fluido (n)) resultaram em um grande desvio padrão das estimativas dos parâmetros. O índice de comportamento do fluido revelou-se não correlacionado com nenhuma das variáveis medidas, mas estudos anteriores sugerem um valor constante desse índice em fermentações filamentosas. Portanto, decidiu-se fixar esse parâmetro em seu valor médio, reduzindo assim o desvio padrão das estimativas dos parâmetros reológicos restantes de modo considerável. Com o uso de um modelo de PLSR, possibilitou-se uma previsão razoável de viscosidade aparente (μapp), tensão de cedência (τy) e índice de consistência (K) com base nas distribuições do tamanho das partículas, na concentração da biomassa e nas informações do processo. Isso propicia um método de alto poder preditivo para a reologia do caldo de fermentação que tem sobre os modelos anteriores a vantagem de permitir a previsão de τy, K e também μapp. A validação em um conjunto de testes independentes produziu um erro quadrático médio de 1,21 Pa em τy, 0,209 Pa sn em K e 0,0288 Pa s em μapp, o que corresponde a R2 = 0,95, R2 = 0,94 e R2 = 0,95, respectivamente. © 2007 Wiley Periodicals, Inc.


Bodizs, L., Titica, M., Faria, N., Srinivasan, B., Dochain, D., Bonvin, D.
"Oxygen control for an industrial pilot-scale fed-batch filamentous fungal fermentation"
Journal of Process Control, 17 (7), pp. 595-606. (2007)

Resumo

As fermentações industriais de fungos filamentosos costumam ser de tipo "fed-batch". O controle do oxigênio representa um importante desafio operacional devido à concentração variável da biomassa. Neste estudo, o controle do oxigênio é implementado por meio da manipulação da taxa de alimentação do substrato, ou seja, da taxa de consumo do oxigênio. Ocorre que o setpoint do oxigênio dissolvido representa um trade-off, já que um baixo valor de oxigênio dissolvido favorece a produtividade, mas também pode induzir a limitação do oxigênio. Este artigo trata da regulação do oxigênio dissolvido por meio de um esquema de controle em cascata que incorpora medidas auxiliares para melhorar o desempenho do controle. O cálculo do perfil apropriado do setpoint do oxigênio dissolvido é solucionado por meio da otimização do processo. Para tanto, ampliou-se um modelo de estruturação morfológica existente inclui os efeitos tanto de baixos níveis de oxigênio sobre o crescimento quanto de propriedades reológicas do meio sobre a transferência do oxigênio. Os resultados experimentais obtidos em nível de escala piloto industrial confirmam a eficiência da estratégia de controle proposta, além de ilustrar as deficiências do modelo do processo em questão para otimizar os setpoints do oxigênio dissolvido. © 2007 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.


Hewitt, C.J., Papapanagiotou, P.A., Quinn, H., Molitor, J.P., Stocks, S.M., Nienow, A.W.
"The use of emulsification technologies to enhance rapeseed oil consumption during industrial Streptomyces rimosus fed-batch fermentations"
Chemical Engineering Research and Design, 85 (7 A), pp. 1072-1078. (2007)

Resumo

Empregaram-se as tecnologias de temperatura de inversão de fases (TIF) e autoemulsificação (AE) para produzir novas formas de alimentação a óleo para fermentações fed-batch. A busca dessas novas formas teve como objetivo não só melhorar a utilização do óleo e o título do produto como também reduzir a viscosidade do caldo de fermentação. O estudo envolveu fermentações industriais de Streptomyces rimosus alimentadas com óleo de canola para produção de oxitetraciclina. Em todos os casos, a utilização de óleo aumentou em comparação com o processo de controle. Além disso, houve também uma redução muito significativa (∼50%) na concentração final de óleo residual quando se usaram as tecnologias de TIF ou de autoemulsificação. Ademais, ocorreu uma redução significativa (∼75%) na viscosidade do caldo de cultura quando se usou o método da autoemulsificação. Concluiu-se que o aumento mensurável na utilização de óleo se deveu à formação de gotículas de óleo menores e mais estáveis promovidas quando essas tecnologias foram usadas e/ou à menor viscosidade do caldo, o que aumentou a transferência de massa do complexo meio de fermentação para as células. Em todos os casos, a concentração e o tempo de atenuação finais da oxitetraciclina não foram significativamente diferentes em qualquer dos processos de fermentação. © 2007 Institution of Chemical Engineers.


Jørgensen, T.R., vanKuyk, P.A., Poulsen, B.R., Ruijter, G.J.G., Visser, J., Iversen, J.J.L.
"Glucose uptake and growth of glucose-limited chemostat cultures of Aspergillus niger and a disruptant lacking MstA, a high-affinity glucose transporter"
Microbiology, 153 (6), pp. 1963-1973. (2007)

Resumo

Este estudo aborda a captação de alta afinidade com a glicose no Aspergillus niger e o efeito da disrupção de um gene transportador de alta afinidade com monossacarídeos, o mstA. A constante de saturação do substrato (Ks) da cepa de referência foi de cerca de 15 μM em cultura em quimiostato com limitação de glicose. A disrupção do mstA provocou uma redução de duas a cinco vezes maior na afinidade com a glicose, levando à expressão de um gene transportador de baixa afinidade com a glicose, o mstC, em alta taxa de diluição. O efeito da disrupção do mstA foi mais sutil a taxas baixas e médias de diluição, o que aponta para um certo grau de redundância funcional no sistema de captação de alta afinidade do A. niger. O disruptor do mstA e uma cepa de referência foram cultivados em culturas em quimiostato com limitação de glicose a taxas baixa, média e alta de diluição (D=0,07 h-1, 0,14 h-1 e 0,20 h-1). O micélio coletado em culturas de estado estável foi submetido a ensaios de captação de glicose e sua expressão do mstA e de dois outros genes transportadores, o mstC e o mstF, foi analisada. A capacidade de captação de glicose (vmáx) de ambas as cepas reduziu-se significativamente em baixa taxa de diluição. Os ensaios de captação de glicose revelaram uma cinética de captação complexa. Isso impediu a determinação precisa das taxas máximas de captação específica (vmáx) e das constantes de afinidade aparente (Kmapp) a taxas média e alta de diluição. Dois genes transportadores de alta afinidade com a glicose, o mstA e o mstF, foram expressos em todas as três taxas de diluição nas culturas em quimiostato, ao contrário do que se verificou na cultura em lote, onde só houve expressão do mstC. Os padrões de expressão dos três genes transportadores sugeriram regulação e funcionalidade diferenciais de seus produtos. © 2007 SGM.


Eriksen, N.T., Riisgård, F.K., Gunther, W.S., Lønsmann Iversen, J.J.
"On-line estimation of O2 production, CO2 uptake, and growth kinetics of microalgal cultures in a gas-tight photobioreactor"
Journal of Applied Phycology, 19 (2), pp. 161-174. (2007)

Resumo

Investigou-se o crescimento das algas verdes Chlamydomonas reinhardtii e Chlorella sp. em culturas em lote com o emprego de um novo fotobiorreator estanque, no qual CO2, H2 e N2 foram titulados na fase gasosa para controlar o pH, a pressão parcial do oxigênio dissolvido e a pressão do headspace do meio, respectivamente. Promoveu-se a circulação do gás da saída do reator por meio de um loop de tubos antes de sua reintrodução na cultura. Estimou-se a captação de CO2 com base no acréscimo do CO2 como titulador ácido e a evolução de O2 com base na titulação por H2, usado para reduzir o O2 sobre um catalisador Pd. Estimou-se o quociente fotossintético, QF, como a razão entre a taxa de evolução de O2 e a taxa de captação de CO2. NH4+, NO2- ou NO3- foi o nutriente responsável por limitar a densidade celular final. Em geral, as culturas de ambas as algas caracterizaram-se por uma fase de crescimento rica em nitrogênio seguida de outra, pobre em nitrogênio, cujo principal produto é o amido. Os valores estimados do QF dependiam do nível de oxidação da fonte de nitrogênio. O QF foi 1 quando a fonte de nitrogênio era o NH4+ e 1.3 quando esta era o NO3-. Nas culturas criadas com todas as fontes de nitrogênio, o valor do QF aproximou-se de 1 quando a fonte de nitrogênio se esgotou e a síntese de amido tornou-se predominante, aumentando para cerca de 1,3 ao longo de 3–4 dias. Esse último aumento do QF, que indicou a produção de menos compostos como lipídios, correlacionou-se a um aumento simultâneo no grau de redução da biomassa. Quando as titulações de CO2 e H2 foram usadas no espaço livre do reator para estimar a captação de CO2, a produção de O2 e o QF, foi possível acompanhar a taxa de produção de biomassa, estimar a composição estequiométrica da biomassa de algas produzida e identificar diferentes fases de crescimento. © 2006 Springer Science+Business Media, Inc.

Mead, D., Pearson, D., Devine, M.
"Recombinant human albumin: Applications as a biopharmaceutical excipient"
Innovations in Pharmaceutical Technology, (22), pp. 42-44. (2007)

Wigley, A., Wilkinson, D., Mead, D.
"Managing scale-up of recombinant proteins"
Genetic Engineering and Biotechnology News, 27 (2), pp. 40+42. (2007)

Mortensen, P.P., Bro, R.
"Real-time monitoring and chemical profiling of a cultivation process"
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 84 (1-2 SPEC. ISS.), pp. 106-113. (2006)

Resumo

Desenvolveu-se um método para avaliação em linha da qualidade de um processo de cultivo a fim de possibilitar (1) melhor controle de processo, (2) detecção mais rápida do end-point do lote e (3) avaliação imediata da qualidade do produto final. As medições de excitação-emissão de fluorescência são usadas porque é sabido que elas refletem importantes propriedades do processo de fermentação. Enfocaram-se também questões importantes da amostragem, em especial os métodos de amostragem primária de estrutura sub-ótima que afetam a representatividade obtida com relação às características dos lotes. Várias diferentes abordagens de calibração para previsão da qualidade do produto (atividade enzimática) são investigadas. Os dados da fluorescência também são modelados por um modelo PARAFAC, propiciando uma visualização quimicamente interpretável da variação do processo, assim enriquecendo as possibilidades de ganho de uma profunda compreensão do processo. Os resultados de nossas investigações mostram que a atividade das enzimas pode ser diretamente prevista a partir das medições de fluorescência, com uma incerteza comparável à da análise química de referência da atividade enzimática. O perfil químico do processo de cultivo com uso do PARAFAC verifica a compreensão básica do processo de cultivo. Identificou-se o perfil de um marcador enzimático, bem como o perfil de um triptofano (marcador proteico). © 2006 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.


Agbogbo, F.K., Coward-Kelly, G., Torry-Smith, M., Wenger, K.S.
"Fermentation of glucose/xylose mixtures using Pichia stipitis"
Process Biochemistry, 41 (11), pp. 2333-2336. (2006)

Resumo

Fermentaram-se diferentes misturas de glicose/xilose sintéticas (total de açúcar: 60 g/l) para criar etanol usando P. stipitis CBS 6054. A glicose foi o substrato preferencial nas misturas de glicose/xilose. As frações de alto teor de glicose tiveram maior taxa de produção de biomassa celular e, portanto, maior taxa de consumo de substrato e de produção de etanol que as frações de alto teor de xilose. Porém as frações de alto teor de xilose tiveram ganhos de etanol ligeiramente mais altos em comparação às frações de alto teor de glicose porque o substrato foi canalizado para a produção de etanol, e não de biomassa celular. A concentração máxima de etanol foi de 22,7 e 24,3 g/l em meios de 60 g/l de glicose e xilose, respectivamente. Quando se usou a mesma concentração celular inicial de 2 g/l, a fermentação concluiu-se após 96 h (100% glicose, 60 g/l) e após 120 h (100% xilose, 60 g/l). © 2006 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.


Diano, A., Bekker-Jensen, S., Dynesen, J., Nielsen, J.
"Polyol synthesis in Aspergillus niger: Influence of oxygen availability, carbon and nitrogen sources on the metabolism"
Biotechnology and Bioengineering, 94 (5), pp. 899-908. (2006)

Resumo

A produção de poliol no Aspergillus niger tem sido estudada em diferentes condições. As fermentações têm sido promovidas com alta concentração de glicose ou xilose como fonte de carbono e amônia ou nitrato como fonte de nitrogênio. O crescimento da biomassa como hifas livremente dispersas levou ao aumento da viscosidade do meio e, por conseguinte, à redução da transferência de massa, em especial de oxigênio. A consequência foi o decréscimo da tensão de oxigênio dissolvido (DOT, na sigla em inglês) e a ocorrência de uma troca de condições inteiramente aeróbicas por condições de limitação de oxigênio. A quantificação de metabólitos mostrou que os polióis eram os principais produtos metabólicos formados, representando até 22% do carbono consumido em condições de limitação de oxigênio. A concentração e o padrão dos polióis dependiam muito das condições do ambiente. Isso se deve à complexa regulação da produção de polióis e ao fato de que cada poliol pode cumprir diferentes funções. Neste estudo, produziram-se eritritol, xilitol e arabitol como compostos de armazenamento de carbono quando o fluxo pela via das pentoses-fosfato excedia a necessidade de síntese de biomassa da ribulose-5-fosfato. Aparentemente, o glicerol, o eritritol e o xilitol estão envolvidos na osmorregulação. Produziu-se manitol quando a redução catabólica da carga era alta. Sua produção envolve a enzima dependente de NAD (nicotinamida adenina dinucleotídeo) manitol-1-fosfato desidrogenase e parece ser a principal via citosólica para a reoxidação de NADH durante a limitação de oxigênio. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.


Haack, M.B., Olsson, L., Hansen, K., Lantz, A.E.
"Change in hyphal morphology of Aspergillus oryzae during fed-batch cultivation"
Applied Microbiology and Biotechnology, 70 (4), pp. 482-487. (2006)

Resumo

As enzimas industriais costumam ser produzidas por fungos filamentosos em cultivos de tipo "fed-batch". Durante o cultivo, as distintas morfologias exibidas pelos fungos têm impacto sobre a produção geral. Investigou-se a morfologia de uma cepa de Aspergillus oryzae produtora de lipase recombinante durante cultivos "fed-batch". Durante a fase exponencial do lote desses cultivos, houve um aumento do comprimento médio das hifas equivalente ao do número de extremidades de cada hifa. Mais impressionante foi o achado de que o fator médio de aumento do diâmetro das hifas durante a fase do lote foi de 1,5, passando de 2,8–2,9 a 4,0–4,4 μm. O diâmetro das hifas permaneceu constante, em torno de 4 μm, após o início da alimentação. Entretanto, o diâmetro da extremidade hifal, onde supostamente ocorre a secreção de enzimas, cresceu drasticamente (fator de 2,5) durante o período de alimentação. A expressão da lipase recombinante foi induzida pela alimentação com maltose, tendo-se observado um aumento na atividade da lipase paralelamente a uma inchação das extremidades. Os resultados indicam que os dois eventos estão ligados, já que também se observou um retorno ao crescimento normal após o cessar da produção em função da limitação de oxigênio. © Springer-Verlag 2005.


Sianidis, G., Pozidis, C., Becker, F., Vrancken, K., Sjoeholm, C., Karamanou, S., Takamiya-Wik, M., Van Mellaert, L., Schaefer, T., Anné, J., Economou, A.
"Functional large-scale production of a novel Jonesia sp. xyloglucanase by heterologous secretion from Streptomyces lividans"
Journal of Biotechnology, 121 (4), pp. 498-507. (2006)

Resumo

Isolou-se o gene que codifica uma nova xiloglucanase (XEG) pertencente à família 74 das hidrolases de glicosídeos de uma cepa de Jonesia sp. por meio de triagem funcional em Escherichia coli. A xiloglucanase codificada é uma proteína de 972 resíduos de aminoácilos com um peptídeo sinalizador de 23 resíduos na porção amino-terminal. Não se verificou superexpressão da XEG em B. subtilis nem em E. coli. Por outro lado, observou-se que a XEG foi superexpressa e secretada em Streptomyces lividans TK24. Para tal, promoveu-se a fusão C-terminal da XEG com o peptídeo sinalizador secretório da proteína inibidora da subtilisina (vsi) do Streptomyces venezuelae. O peptídeo sinalizador nativo da XEG derivado da Jonesia sp. apresenta baixa funcionalidade em S. lividans. Em condições ótimas de crescimento, segregam-se quantidades significativas de XEG madura (100–150 mg/l) no meio de cultura empregado. Elaborou-se um protocolo que purificasse rapidamente a XEG dos sobrenadantes da cultura.para torná-la homogênea. Análises biofísicas e bioquímicas indicam que a enzima está intacta, estável e plenamente funcional. Constatou-se que a XEG é o mais longo polipeptídeo heterólogo secretado de S. lividans. Além disso, o presente estudo valida o uso de S. lividans para produção de proteínas heterólogas ativas e demonstra que polipeptídeos heterólogos de até 100 kDa também podem ser submetidos a este sistema.


Johansson, L., Lindskog, A., Silfversparre, G., Cimander, C., Nielsen, K.F., Lidén, G.
"Shikimic acid production by a modified strain of E. coli (W3110.shik1) under phosphate-limited and carbon-limited conditions"
Biotechnology and Bioengineering, 92 (5), pp. 541-552. (2005)

Resumo

O ácido chiquímico é uma dentre várias matérias-primas quirais industrialmente interessantes, formada na via de aminoácidos aromáticos em plantas e microrganismos. Neste estudo, comparou-se a fisiologia de uma cepa de Escherichia coli (derivada de W3110) produtora de ácido chiquímico eliminada no aroL (gene codificador da chiquimato quinase, isoforma II) à fisiologia de uma cepa de controle correspondente (W3110) em condições de limitação de carbono e fosfato. No caso da cepa produtora de ácido chiquímico (denominada W3110.shik1), a limitação de fosfato resultou em maior produção de ácido chiquímico (0,059 ± 0,012 x 0.024 ± 0,005 c-mol/c-mol) e menor produção de subprodutos da via do chiquimato, quando comparada à limitação de carbono. A produção do subproduto 3-desidrochiquimato (DHS) caiu de 0,076 ± 0,028 para 0,022 ± 0,001 c-mol/c-mol. Diversos outros subprodutos só foram detectados em condições de limitação de carbono. Nesse último grupo incluem-se o 3-desidroquinato (0,021 ± 0,021 c-mol/c-mol), o ácido quínico (0,012 ± 0,005 c-mol/c-mol) e o ácido gálico (0,002 ± 0,001 c-mol/c-mol). Em ambas as cepas, produziu-se mais acetato sob condições de limitação de fosfato que de carbono. A limitação de fosfato gerou um aumento considerável da lise celular em ambas as cepas, embora este tenha sido maior em W3110.shik1. Portanto, as vantagens da limitação de fosfato em termos do aumento da produção de ácido chiquímico foram contrabalançadas pelo aumento da lise celular, o que poderá dificultar o processamento downstream. © 2005 Wiley Periodicals, Inc. 


Jürgen, B., Tobisch, S., Wümpelmann, M., Gördes, D., Koch, A., Thurow, K., Albrecht, D., Hecker, M., Schweder, T.
"Global expression profiling of Bacillus subtilis cells during industrial-close fed-batch fermentations with different nitrogen sources"
Biotechnology and Bioengineering, 92 (3), pp. 277-298. (2005)

Resumo

Conduziu-se uma análise detalhada da expressão gênica de processos de fermentação fed-batch quase industriais de Bacillus subtilis cuja única fonte de nitrogênio está na concentração reduzida de casaminoácidos, porém suplementada com amônia. Embora a glutamina e a arginina sejam supostamente as fontes preferenciais de nitrogênio do B. subtilis, demonstramos que a alimentação conjunta de amônia e casaminoácidos respalda o crescimento celular em fermentações do tipo "fed-batch". As análises do transcriptoma e do proteoma revelaram que a alimentação adicional de amônia, combinada à concentração reduzida de aminoácidos, promove um nível de expressão significativamente menor dos genes glnAR ou tnrA, codificadores de proteínas geralmente envolvidos no metabolismo de nitrogênio do B. subtilis. Entretanto,os níveis de mRNA dos genes dos óperons ilvBHC-leuABD d hom-thrCB aumentaram consideravelmente, o que indica uma limitação de valina, leucina, isoleucina e treonina nessas condições de fermentação. Por outro lado, durante a fermentação que tem nos casaminoácidos a única fonte de nitrogênio, vários genes de papel crucial no metabolismo de nitrogênio do B. subtilis (ex.: glnAR, nasCDE, nrgAB.e ureAB) foram suprarregulados, o que indica uma limitação de nitrogênio nessas condições. Além disso, determinou-se uma maior expressão dos genes envolvidos na motilidade e quimiotaxia (ex.: hag, fliT) e no metabolismo da acetoína (ex.: acoABCL) durante a fermentação com a fonte mista (casaminoácidos e amônia) de nitrogênio, indicando uma limitação de carbono nessas condições de fermentação. Em condições de alta densidade celular e crescimento lento, observou-se fraca suprarregulação dos genes responsáveis pela autólise e indução de inúmeros genes envolvidos na motilidade, na quimiotaxia e na reação geral ao estresse. Os resultados do presente estudo permitiram a seleção de genes marcadores que podem ser usados no monitoramento dos processos de fermentação do B. subtilis. Os dados sugerem, por exemplo, o gene acoA para marcação da limitação de glicose e o gene glnA para indicação da limitação de nitrogênio. © 2005 Wiley Periodicals, Inc.


Aiello-Mazzarri, C., Coward-Kelly, G., Agbogbo, F.K., Holtzapple, M.T.
"Conversion of municipal solid waste into carboxylic acids by anaerobic countercurrent fermentation: Effect of using intermediate lime treatment"
Applied Biochemistry and Biotechnology, 127 (2), pp. 79-93. (2005)

Resumo

Combinaram-se resíduos sólidos urbanos (RSU) e lamas de depuração (LD) para conversão anaeróbica em sais de carboxilato por meio de uma cultura mista de microrganismos formadores de ácidos. OS RSU são uma fonte de energia e as LD, uma fonte de nutrientes. Neste estudo, eles foram conjugou para se complementar uns aos outros. Quatro fermentadores foram arrumados em série para obter um processo de fermentação em contracorrente. Nesse processo, os sólidos e o líquido foram transportados em direções opostas, com o acréscimo de biomassa fresca ao fermentador 1 e de meio líquido fresco ao fermentador 4. Aplicou-se um tratamento intermediário com cal aos sólidos na saída do fermentador 3 (antes da entrada no fermentador 4), a fim de aumentar a concentração de ácidos do produto das fermentações não tratadas de RSU/LD. Todas as fermentações foram realizadas em condições anaeróbicas a 40 °C. Acrescentou-se carbonato de cálcio para neutralizar os ácidos carboxílicos e controlar o pH. Como inibidor de metanógenos, foi usado iodofórmio. A concentração de ácidos carboxílicos e a composição do gás foram determinadas por cromatografia gasosa. A conversão do substrato foi medida pela perda de sólidos voláteis, e a produtividade dos ácidos carboxílicos foi calculada como função do total de ácidos carboxílicos produzidos, do volume de líquido em todos os fermentadores e do tempo. O acréscimo do tratamento intermediário com cal aumentou a concentração e a conversão do produto em aproximadamente 30 e 15%, respectivamente. As concentrações mais altas de ácidos carboxílicos nas fermentações não tratadas de RSU/LD com e sem tratamento intermediário com cal foram de 22,2 e 17,7 g de ácido carboxílico/litro de líquido, respectivamente. Esses resultados confirmam que o acréscimo de uma etapa de tratamento entre o fermentador 3 e o fermentador 4 aumentará a digestibilidade e a produtividade dos ácidos da fermentação. Copyright © 2005 by Humana Press Inc. Todos os direitos reservados.


Kvist, T., Thyregod, P.
"Using evolutionary operation to improve yield in biotechnological processes"
Quality and Reliability Engineering International, 21 (5), pp. 457-463. (2005)

Resumo

No setor da biotecnologia, a produção muitas vezes se caracteriza por relativamente poucos lotes maiores. Nos estágios de concepção de um novo processo, o uso de métodos estatísticos para experimentação podem propiciar informações muito valiosas sobre o processo. Porém frequentemente se descobre que as condições ótimas do laboratório ou planta piloto apresentam rendimentos inferiores quando transferidas para a produção em larga escala. Isso se deve aos efeitos da produção em escala comercial e às grandes variações inerentes à lida com material e processos biológicos como o da fermentação. Na produção em larga escala, não há a mesma liberdade de experimentação que na produção em escala de laboratório. Os ensaios simples, que abordam um fator de cada vez, predominam quando se tenta melhorar o rendimento na escala da produção. Assim, torna-se possível controlar o resultado de modo que ele atenda aos requisitos. Entretanto, essa é uma forma muito ineficiente de conduzir experimentos. Os requisitos para um procedimento experimental alternativo são: ele deve ser robusto no que se refere a variações não controláveis, ele deve conter salvaguardas automáticas que impeçam a fabricação de material insatisfatório e ele deve permitir a tomada de decisões durante o ensaio. Além disso, é importante que o estágio do planejamento seja curto e que a interpretação seja clara e direta. O método da operação evolutiva (EVOP, na sigla em inglês) sugerido por George Box preenche esses requisitos. Apresentamos a implementação do EVOP em uma grande empresa biotecnológica da Dinamarca. Fornecemos um exemplo de uso do método no processo de fermentação de uma enzima industrial. No exemplo em questão, o rendimento do processo aumentou 45%. Copyright © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.


De Maré, L., Velut, S., Ledung, E., Cimander, C., Norrman, B., Karlsson, E.N., Holst, O., Hagander, P.
"A cultivation technique for E. coli fed-batch cultivations operating close to the maximum oxygen transfer capacity of the reactor"
Biotechnology Letters, 27 (14), pp. 983-990. (2005)

Resumo

Apresenta-se uma estratégia de cultivo que alia as vantagens da alimentação em lote com limitação de temperatura ao controle por sondagem da alimentação. A técnica foi avaliada em cultivos de tipo "lote alimentado" com E. coli BL21(DE3) para produção de xilanase em um biorreator de 3 litros. Obteve-se um aumento de 20% na massa celular, e a habitual redução de atividade da enzima específica normalmente observada durante a fase final da produção diminuiu com a nova técnica. O método foi testado ainda cultivando-se E. coli W3110 em um biorreator maior (50 litros). Trata-se de uma técnica de cultivo adequada quando se atinge a capacidade de transferência de O2 do reator e se deseja continuar produzindo a proteína recombinante. © Springer 2005.


Schmidt, R.A., Wiebe, M.G., Eriksen, N.T.
"Heterotrophic high cell-density fed-batch cultures of the phycocyanin-producing red alga Galdieria sulphuraria"
Biotechnology and Bioengineering, 90 (1), pp. 77-84. (2005)

Resumo

Investigou-se o crescimento e a produção de ficocianina nas culturas em lote e fed-batch da microalga Galdieria sulphuraria 074G, criada heterotroficamente no escuro em glicose, frutose, sacarose e melaço de beterraba sacarina. Nas culturas em lote, as taxas de crescimento específico e ganho de peso seco de biomassa com os açúcares puros foram 1,08–1,15 dia-1 e 0,48–0,50 g g-1, respectivamente. Elas foram ligeiramente mais altas quando a fonte de carbono foi o melaço. O conteúdo celular de ficocianina durante a fase exponencial do crescimento foi de 3–4 mg g-1 em peso seco. A G. sulphuraria mostrou-se tolerante a concentrações de glicose e frutose de até 166 g L-1 (0,9 M) e a uma concentração de 22 g L-1 (0,17 M) de sulfato de amônia sem apresentar efeitos negativos sobre a taxa de crescimento específico. Quando a concentração total de substâncias dissolvidas no meio de crescimento excedeu 1–2 M, o crescimento foi completamente inibido. Nas culturas do tipo "fed-batch" com limitação de carbono, obtiveram-se concentrações de peso seco de biomassa de 80–120 g L-1, enquanto o acúmulo de ficocianina atingiu concentrações entre 250 e 400 mg L-1. Esses resultados demonstram que a G. sulphuraria adéqua-se ao crescimento em culturas heterotróficas a densidades celulares muito altas e que tais culturas produzem quantidades significativas de ficocianina. Além disso, a produtividade da ficocianina nas culturas fed-batch heterotróficas de G. sulphuraria foi mais alta que a produtividade obtida em culturas ao ar livre de Spirulina platensis, atual fonte de geração da ficocianina. © 2005 Wiley Periodicals, Inc.


Stocks, S.M., Cooke, M., Heggs, P.J.
"Inverted hollow spinning cone as a device for controlling foam and hold-up in pilot scale gassed agitated fermentation vessels"
Chemical Engineering Science, 60 (8-9 SPEC. ISS.), pp. 2231-2238. (2005)

Resumo

Demonstra-se a eficácia de um cone oco invertido rotativo (COIR) no controle da retenção de líquido e espuma em equipamento em escala piloto para fermentação de um bacilo recombinante explorado comercialmente na atualidade, com os problemas característicos de retenção e formação de espuma desse gênero. O cone gira no eixo do agitador existente no nível operacional de produção normal. Conduziu-se uma série de nove ensaios em fermentadores de 550 litros em escala piloto:duas fermentações sem acréscimo de agente de controle de espuma (ACE), quatro controles com acréscimo de ACE quando necessário e três com uso do cone como único método de controle do nível. Os lotes conduzidos sem acréscimo de ACE ou uso de um COIR perderam 52 ± 15 kg de caldo pelo sistema de exaustão. Os lotes conduzidos com acréscimo de ACE quando necessário ou uso do COIR apresentaram ao fim um volume estatisticamente indissociável de 308 ± 6 kg e 319 ± 13 kg, respectivamente. O desempenho do processo em termos da titulação de enzimas não foi afetado. Esses resultados alentadores indicam grande economia potencial nos custos tanto da fermentação quanto da recuperação, já que o acréscimo de ACE pode ser completamente evitado. Justifica-se uma avaliação da produção em larga escala. © 2004 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.


Bhargava, S., Wenger, K.S., Rane, K., Rising, V., Marten, M.R.
Effect of cycle time on fungal morphology, broth rheology, and recombinant enzyme productivity during pulsed addition of limiting carbon source
Biotechnology and Bioengineering, 89 (5), pp. 524-529. (2005)

Resumo

Durante muitos anos, a alta viscosidade do caldo foi um desafio fundamental nas fermentações de fungos filamentosos em larga escala. Em estudos anteriores, demonstramos que a viscosidade do caldo poderia ser reduzida pelo acréscimo pulsado de carbono limitante durante a fermentação fed-batch. O objetivo deste estudo foi determinar como a alteração da frequência do acréscimo pulsado de substrato afeta a morfologia dos fungos, a reologia do caldo e a produtividade das enzimas recombinantes. Para isso, conduziu-se uma série de fermentações fed-batch duplicadas em fermentadores de 20 litros com uma cepa de Aspergillus oryzae produtora de glucoamilase recombinante. A variação do tempo de ciclo total de pulsagem do substrato obedeceu a uma ampla faixa (30–2, 700 s), com acréscimo de substrato apenas durante os primeiros 30% de cada ciclo. Para controle, realizou-se uma fermentação com alimentação contínua de substrato. Em todas as fermentações, acrescentou-se o mesmo total de substrato. Os resultados mostram que a concentração total de biomassa se manteve relativamente inalterada, ao passo que foi observada uma redução substancial na área média projetada dos fungos (ou seja, tamanho médio) com o aumento do tempo de ciclo. Isso levou à redução da viscosidade do caldo e ao aumento da taxa de captação de oxigênio. Entretanto, os valores altos do tempo de ciclo (ou seja, 900–2, 700 s) mostraram um aumento considerável da formação de conídios fúngicos e uma redução significativa da produtividade das enzimas recombinantes, o que sugere que os fungos canalizaram substrato para compostos de armazenamento, e não para a proteína recombinante. Além de explicar o efeito do tempo de ciclo sobre o desempenho da fermentação, esses resultados podem ajudar a explicar também as discrepâncias observadas no redimensionamento para fermentadores maiores. © 2005 Wiley Periodicals, Inc.


Hornbæk, T., Jakobsen, M., Dynesen, J., Nielsen, A.K.
"Global transcription profiles and intracellular pH regulation measured in Bacillus licheniformis upon external pH upshifts"
Archives of Microbiology, 182 (6), pp. 467-474. (2004)

Resumo

Para otimização das condições de propagação de um Bacillus licheniformis de uso industrial, este estudo examina o efeito da transferência de células na fase estacionária inicial do crescimento (pH 5,3) para um novo meio de cultura de pH 5,0–8,0. Mediu-se o pH intracelular (pHi) a nível de cada célula por meio de microscopia por imagem da taxa de fluorescência após coloração com 5(6)-carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFDA-SE). Os perfis de transcrição foram determinados com o uso de um microarranjo de DNA genômico. Descobriu-se que o valor do pH extracelular (pH ex) ótimo para o crescimento de B. licheniformis era 7,0, pois promovia a fase de adaptação mais curta, a maior taxa de crescimento específico máximo e a máxima formação de biomassa. Detectou-se em B. licheniformis um gradiente de pH (ΔpH = pHi - pHex) médio de aproximadamente 1,0 15 minutos após a transferência para o pHex 5,0–8,0. A suprarregulação dos genes envolvidos na captação de sacarose em pH 7,0 poderia estar relacionada ao crescimento ótimo observado. Os perfis de transcrição indicaram que o organismo sofria privação de fosfato com a transferência para o pH 7,0 e o pH 8,0. Os mecanismos envolvidos na regulação do pHi pareciam incluir alterações na síntese de ácidos graxos, produzindo uma estrutura de membrana celular mais rígida com baixos valores de pHex e conversão de piruvato em acetoína, em vez de acetato, para neutralização do baixo pHex. © Springer-Verlag 2004.


Raghevendran, V., Gombert, A.K., Christensen, B., Kötter, P., Nielsen, J.
"Phenotypic characterization of glucose repression mutants of Saccharomyces cerevisiae using experiments with 13 C-labelled glucose"
Yeast, 21 (9), pp. 769-779. (2004)

Resumo

No campo da engenharia metabólica e da genômica funcional, os métodos propícios à análise dos fluxos metabólicos celulares são bem-vindos por darem uma visão geral da resposta fenotípica das células a nível da rede metabólica ativa. Isso não ocorre em várias outras técnicas experimentais de alto rendimento, as quais não fornecem informações sobre a resposta integrada da função celular a uma modificação genética específica. Neste estudo, procedemos à caracterização fenotípica de vários mutantes da levedura Saccharomyces cerevisiae por meio de experimentos com glicose marcada com 13C. Através da análise por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (CG-EM) da 13C incorporada aos aminoácidos das proteínas celulares, foi possível obter informações quantitativas sobre a função do metabolismo central do carbono nos diferentes mutantes. Tradicionalmente, tais dados de marcação têm sido usados para quantificar fluxos metabólicos por meio do uso de um modelo matemático adequado, mas aqui mostramos que, mesmo antes do processamento, esses dados podem ser usados diretamente para caracterização fenotípica de diferentes cepas de mutantes. As diferentes cepas com supressão da repressão de glicose investigadas e empregadas são os mutantes de disrupção reg1, hxk2, grr1, mig1 e mig1mig2 e a cepa de referência, CEN.PK113-7D. A análise dos principais componentes da soma dos dados da marcação fracionada mostra que a eliminação dos genes HXK2 e GRR1 acarreta um fenótipo semelhante no nível do fluxoma, with a partial alleviation of repressão à glicose no metabolismo respiratório. Além disso, a eliminação dos genes MIG1, MIG1/MIG2 e REG1 não acarretou mudança significativa do fenótipo no nível do fluxoma. Copyright © 2004 John Wiley & Sons, Ltd.


Connelly, M.B., Young, G.M., Sloma, A.
"Extracellular proteolytic activity plays a central role in swarming motility in Bacillus subtilis"
Journal of Bacteriology, 186 (13), pp. 4159-4167. (2004)

Resumo

Os isolados naturais de Bacillus subtilis exibem um robusto comportamento multicelular conhecido como "swarming". O swarming é uma forma de motilidade que se caracteriza pela progressão rápida e coordenada de uma população bacteriana ao longo de uma superfície. Por ser um processo bacteriano coletivo, o swarming muitas vezes é associado à formação de biofilme e tem sido vinculado à expressão do fator virulência em bactérias patogênicas. Embora o fenótipo do swarming na espécie Bacillus tenha sido bem documentado, a compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis permanece em grande parte restrita a bactérias Gram-negativas. Para melhor entender o controle do swarming em membros do gênero Bacillus, investigamos o efeito de uma série de eliminações de genes em sua motilidade característica. Nossa análise revelou que uma cepa deficiente para a produção de surfactina e atividade proteolítica extracelular não exibe swarm nem forma biofilme. Embora se saiba que a surfactina, uma lipoproteína surfactante, atue na motilidade do swarming por meio da redução da tensão superficial, este é o primeiro relatório que demonstra que a atividade extracelular geral da protease também desempenha uma importante função. Esses resultados não só contribuem para definir os fatores envolvidos na indução da migração no swarming, como também respaldam a ideia de que o swarming e a formação de biofilme podem ter mecanismos de controle que se sobrepõem.


Hornbæk, T., Nielsen, A.K., Dynesen, J., Jakobsen, M.
"The effect of inoculum age and solid versus liquid propagation on inoculum quality of an industrial Bacillus licheniformis strain"
FEMS Microbiology Letters, 236 (1), pp. 145-151. (2004)

Resumo

Obtiveram-se fases de adaptação mais curtas em cultivos de Bacillus licheniformis com o uso de inoculantes na fase estacionária inicial do crescimento, em vez da fase estacionária final do crescimento, e com o uso de um meio de propagação líquido, em vez de sólido. Após coloração com 5(6)-carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFDA-SE), a citometria de fluxo e a microscopia por imagem da taxa de fluorescência (FRIM, na sigla em inglês) confirmaram maior vitalidade e maior homogeneidade no inoculante líquido na fase estacionária inicial do crescimento que no inoculante sólido na fase estacionária final do crescimento. Análises de microarranjos de DNA indicaram que o inoculante líquido na fase estacionária inicial do crescimento foi mais ativo em termos de multiplicação celular, enquanto o inoculante sólido na fase estacionária final do crescimento foi induzido à formação de alguns esporos, potencialmente retardando o início do crescimento. © 2004 Federation of European Microbiological Societies. Publicado por Elsevier B.V. Todos os direitos reservados.


S. Bhargava; K. Wenger; M. R. Marten.
"Pulsed feeding during fed-batch Aspergillus oryzae fermentation leads to improved oxygen mass transfer."
Biotechnololy Prog. 19, 1091-1094 (2003)

Resumo

A alta viscosidade do caldo e a consequente redução da capacidade de transferência de massa de oxigênio têm efeito prejudicial na produtividade de muitas fermentações de fungos. Aqui, o objetivo foi determinar se a alimentação pulsada de carbono limitante poderia levar à redução da viscosidade e ao aumento da transferência de massa de oxigênio em uma fermentação de fungos. Comparada à alimentação contínua, a alimentação pulsada de substrato produziu fungos menores, o que promoveu uma redução significativa da viscosidade do caldo. Isso, por sua vez, levou a concentrações mais altas de oxigênio dissolvido e taxas mais altas de captação de oxigênio durante a alimentação pulsada.