Vongsangnak, W., Olsen, P., Hansen, K., Krogsgaard, S., Nielsen, J.
"Improved annotation through genome-scale metabolic modeling of Aspergillus oryzae"
BMC Genomics, 9, art. no. 245. (2008)

Resumo

Introdução: desde antigamente, o fungo filamentoso Aspergillus oryzae foi usado na indústria da fermentação para produzir molhos fermentados e enzimas industriais. Recentemente, foi liberada a sequência do genoma do A. oryzae com 12.074 genes anotados, mas o número de proteínas hipotéticas contabilizaram mais de 50% desses genes. Considerando a importância industrial desses fungos, melhorar a anotação e integrar ainda mais as informações genômicas com as informações bioquímicas e fisiológicas disponíveis para esse microrganismo e outros fungos relacionados tem seu valor. Aqui, propomos a previsão do gene por meio da construção de um conjunto, sequenciamento e biblioteca de Marcador de Sequência Expressa (EST, na sua sigla em inglês) do A. oryzae. Aprimoramos a atribuição da função por meio da nossa estratégia de anotação desenvolvida. A anotação com melhor resultado foi usada para reconstruir a rede metabólica, levando a um modelo metabólico em escala de genoma do A. oryzae. Resultados: em nossas sequências de EST montadas, identificamos 1.046 genes recém-previstos no genoma do A. oryzae. Além disso, foi possível atribuir funções da proteína putativa a 398 dos genes recém-previstos. Chama a atenção que a nossa estratégia de anotação tenha resultado na atribuição de novas funções putativas para 1.469 proteínas hipotéticas já presentes no banco de dados do genoma do A. oryzae. Usando o genoma anotado significativamente melhorado, reconstruímos a rede metabólica do A. oryzae. Essa rede contém 729 enzimas, 1.314 genes codificados por enzima, 1.073 metabólitos e 1.846 (1.053 únicas) reações bioquímicas. As reações metabólicas são compartimentadas no citosol, na mitocôndria, no peroxissomo e no espaço extracelular. As etapas de transporte entre os compartimentos e o espaço extracelular representam 281 reações, das quais 161 são únicas. O modelo metabólico foi validado e mostrado para descrever corretamente o comportamento fenotípico do A. oryzae que cresceu em diferentes fontes de carbono. Conclusão: uma anotação muito mais aprimorada do genoma do A. oryzae foi realizada e um modelo metabólico em escala de genoma do A. oryzae foi reconstruído. O modelo previu com precisão o crescimento e a produção de biomassa em diferentes fontes de carbono. O modelo serve como um importante recurso para obter uma visão mais detalhada da nossa compreensão da fisiologia do A. oryzae. © 2008 Vongsangnak et al; licensee BioMed Central Ltd.

 

Martinez, D., Berka, R.M., Henrissat, B., Saloheimo, M., Arvas, M., Baker, S.E., Chapman, J., Chertkov, O., Coutinho, P.M., Cullen, D., Danchin, E.G.J., Grigoriev, I.V., Harris, P., Jackson, M., Kubicek, C.P., Han, C.S., Ho, I., Larrondo, L.F., De Leon, A.L., Magnuson, J.K., Merino, S., Misra, M., Nelson, B., Putnam, N., Robbertse, B., Salamov, A.A., Schmoll, M., Terry, A., Thayer, N., Westerholm-Parvinen, A., Schoch, C.L., Yao, J., Barbote, R., Nelson, M.A., Detter, C., Bruce, D., Kuske, C.R., Xie, G., Richardson, P., Rokhsar, D.S., Lucas, S.M., Rubin, E.M., Dunn-Coleman, N., Ward, M., Brettin, T.S.
"Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecorina)"
Nature Biotechnology, 26 (5), pp. 553-560. (2008)

Resumo
O Trichoderma reesei é a principal fonte industrial de celulases e hemicelulases, que são usadas para despolimerizar a biomassa de açúcares simples que são convertidos em biocombustíveis e intermediários químicos, como o etanol. Montamos 89 andaimes (conjuntos de contíguos ordenados e orientados) para gerar 34 Mbp de sequência quase contígua do genoma do T. reesei, incluindo 9.129 modelos de genes previsíveis. Inesperadamente, considerando a eficácia e a utilidade industrial das enzimas responsáveis pelo metabolismo de carboidratos do T. reesei, seu genoma codifica menos celulases e hemicelulases do que qualquer outro fungo sequenciado capaz de hidrolisar os polissacarídeos da parede celular da planta. As enzimas responsáveis pelo metabolismo de carboidratos que codificam os genes do T. reesei são distribuídas de forma não aleatória em agrupamentos que ficam entre as regiões de sintenia com outros Sordariomycetes. Várias vias biossintéticas de codificação de genes para metabólitos secundários podem promover a sobrevivência do T. reesei no habitat competitivo do solo, mas a análise do genoma forneceu poucas informações mecanicistas sobre sua extraordinária capacidade de secreção de proteína. Nossa análise, combinada com os dados de sequência do genoma, fornece um roteiro para construir cepas aprimoradas do T. reesei para aplicações industriais, como a produção de biocombustível.

 

David, H., Özçelik, I.Ş., Hofmann, G., Nielsen, J.
"Analysis of Aspergillus nidulans metabolism at the genome-scale"
BMC Genomics, 9, art. no. 163. (2008)

Resumo

Introdução: o Aspergillus nidulans é um membro de um grupo diversificado de fungos filamentosos, compartilhando várias propriedades de seus parentes próximos com significância nos campos da medicina, agricultura e indústria. Além disso, o A. nidulans tem sido um modelo clássico de organismo para estudos de biologia do desenvolvimento e regulação de genes, e por isso tornou-se um dos fungos filamentosos melhor caracterizados. Essa foi a primeira espécie Aspergillus a ter seu genoma sequenciado, e ferramentas de previsão de gene automatizadas previram 9.451 quadros de leitura aberta (QLAs) no genoma, com menos de 10% tendo uma função atribuída. Resultados: neste trabalho, atribuímos funções manualmente a 472 genes órfãos no metabolismo do A. nidulans, usando uma abordagem orientada por via e utilizando ferramentas genômicas comparativas baseadas em similaridade de sequência. O metabolismo central do A. nidulans, bem como as vias biossintéticas dos metabólitos secundários relevantes, foram refeitos com base nas reconstruções metabólicas detalhadas do A. niger e Saccharomyces cerevisiae, e nas informações da genética, bioquímica e fisiologia do A. nidulans. Portanto, foi possível identificar as funções metabólicas sem um gene associado e buscar por candidatos de QLAs no genoma do A. nidulans, comparando sua sequência com as sequências de genes bem caracterizados em outras espécies por meio da codificação da função de interesse. Um sistema de classificação baseado em critérios definidos foi desenvolvido para avaliar e selecionar de maneira objetiva e sistemática QLAs entre os candidatos. As atribuições funcionais serviram como base para desenvolver um modelo matemático, vinculando 666 genes (anteriormente e recém-anotados) às funções metabólicas. O modelo foi usado para simular comportamento metabólico e também integrar, analisar e interpretar dados de expressão de gene em grande escala relativos a um estudo sobre repressão de glucose, fornecendo, portanto, um meio para atualizar o conteúdo das informações de dados experimentais e obter uma visão ainda mais detalhada desse fenômeno no A. nidulans. Conclusão: demonstramos como a modelagem da via do A. nidulans pode ser usada como uma abordagem para melhorar a anotação funcional do genoma desse organismo. Além disso, mostramos como o modelo metabólico estabelece vínculos funcionais entre genes, possibilitando a atualização do conteúdo das informações dos dados de transcriptomas. © 2008 David et al; licensee BioMed Central Ltd.

 

Baker, S.E., Thykaer, J., Adney, W.S., Brettin, T.S., Brockman, F.J., D'haeseleer, P., Martinez, A.D., Miller, R.M., Rokhsar, D.S., Schadt, C.W., Torok, T., Tuskan, G., Bennett, J., Berka, R.M., Briggs, S.P., Heitman, J., Taylor, J., Gillian Turgeon, B., Werner-Washburne, M., Himmel, M.E.
"Fungal genome sequencing and bioenergy"
Fungal Biology Reviews, 22 (1), pp. 1-5. (2008)

Resumo

Até o momento, o número de projetos contínuos de sequenciamento do genoma fúngico filamentoso é quase dez vezes menor do que o de projetos de genoma bacteriano e arqueano. Os fungos escolhidos para sequenciamento representam um reino com pouca diversidade; a maioria é de patógenos ou modelos. Defendemos um programa ambicioso de sequenciamento de genoma baseado em filogenéticos progressivos, desenvolvido para capturar a diversidade metabólica no reino dos fungos, aprimorando, assim, a pesquisa de recursos bioenergéticos alternativos, biorremediação e interações no ambiente fúngico.

 

Oh, Y.-K., Palsson, B.O., Park, S.M., Schilling, C.H., Mahadevan, R.
"Genome-scale reconstruction of metabolic network in Bacillus subtilis based on high-throughput phenotyping and gene essentiality data"
Journal of Biological Chemistry, 282 (39), pp. 28791-28799. (2007)

Resumo

Neste relatório, é apresentada uma reconstrução em escala de genoma do metabolismo do Bacillus subtilis e seu desenvolvimento iterativo com base nas informações da combinação genômica, bioquímica e fisiológica, e experimentos de fenotipagem de alto rendimento. A reconstrução inicial foi convertida em um modelo em ambiente virtual e expandido de modo iterativo em quatro etapas. Primeiro, a análise da lacuna de rede foi usada para identificar 48 reações ausentes necessárias para o crescimento, mas que não foram encontradas na anotação do genoma. Segundo, as taxas de crescimento computadas em condições aeróbicas foram comparadas com os dados da triagem fenotípica de alto rendimento, e a inicial no modelo em ambiente virtual pôde prever os resultados qualitativamente em 140 dos 271 casos considerados. A análise detalhada das previsões incorretas resultaram na adição de 75 reações à reconstrução inicial, e 200 de 271 casos foram computados corretamente. Terceiro, as computações em ambiente virtual dos fenótipos de crescimento das cepas knockout foram consistentes com as observações experimentais em 720 dos 766 casos avaliados. Quarto, a análise integrada da utilização em grande escala do substrato e dos dados de essencialidade do gene com o modelo metabólico em escala de genoma revelou a necessidade de 80 enzimas específicas (transporte, 53; reações intracelulares, 27) que não estão na anotação do genoma. A análise subsequente da sequência resultou na identificação dos genes que poderiam ser atribuídos de forma putativa a 13 enzimas intracelulares. A reconstrução final contabilizou 844 quadros de leitura aberta e consistiu de 1.020 reações metabólicas e 988 metabólitos. Portanto, o modelo em ambiente virtual pode ser usado para obter hipóteses que podem ser verificadas experimentalmente nas funções metabólicas de vários genes. © 2007 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

 

Tang, M.R., Sternberg, D., Behr, R.K., Sloma, A., Berka, R.M.
"Use of transcriptional profiling & bioinformatics to solve production problems"
Industrial Biotechnology, 2 (1), pp. 66-74. (2006)

Resumo

A produção de pigmentos durante as fermentações industriais é indesejável, e etapas de purificação caras são frequentemente necessárias para remover compostos coloridos de produtos comerciais antecipados. Observamos que uma cepa do Bacillus subtilis recombinante que sintetiza o ácido hialurônico (HA) do polissacarídeo heterólogo produziu abundantes quantidades de um pigmento vermelho com características de propriedade bioquímica do pulcherrimin, um composto de pirazina de liga de ferro anteriormente caracterizado. Um mutante do B. subtilis apigmentado foi isolado após uma mutagênese química e comparado à sua cepa-mãe usando a análise de transcriptoma do microarranjo de DNA. Entre os genes com transcrição significativamente alterada (p < 0,05) no mutante apigmentado, o yvmC e o cypX foram selecionados como possíveis genes biossintéticos do pulcherrimin, com base no exame de bioinformática em ambiente virtual, que sugeriu que o produto do gene yvmC contém uma característica de domínio da fosfopanteteína putativa de algumas sintases de peptídio cíclico, e o gene cypX codifica uma enzima semelhante ao citocromo P450. A biossíntese do pulcherrimin foi anteriormente proposta para ocorrer por meio da ciclização de duas moléculas de leucina seguida por uma reação redox envolvendo o oxigênio molecular. Além disso, os genes yvmC e cypX estão justapostos no cromossomo do B. subtilis e parecem estar expressos de forma coordenada com base na análise do agrupamento hierárquico dos dados de microarranjo. A ruptura dos genes yvmC ou cypX produziram cepas que não resultaram em pigmento vermelho. Este estudo ilustra que a combinação do perfil transcricional e da bioinformática é uma abordagem eficaz que pode ser utilizada para solucionar problemas de fermentação industrial.

 

Woods, K., Hilu, K.W., Borsch, T., Wiersema, J.H.
"Pattern of variation and systematics of Nymphaea odorata: II. Sequence information from ITS and trnL-trnF"
Systematic Botany, 30 (3), pp. 481-493. (2005)

Resumo

Os dados de sequência do Espaçador interno transcrito (ITS, na sua sigla em inglês) nuclear e das regiões dos plastídios do trnL-trnF foram usados para avaliar as relações entre as populações do N. odorata em sua variedade na América do Norte, e se a subespécie odorata e a subespécie tuberosa formam unidades taxonômicas distintas. A Nymphaea mexicana foi incluída devido à suspeita de hibridização com o N. odorata. A região do trnL-trnF forneceu um único local informativo no N. odorata. Em contraste, a região do ITS foi mais variável. A análise filogenética dos dados do ITS apoia a monofilia das duas espécies. No N. odorata, duas cepas foram resolvidas representando amplamente a subespécie odorata e a subespécie tuberosa, embora alguns indivíduos tenham aparecido fora das respectivas cepas. Os locais polimórficos foram detectados no ITS, indicando possível hibridização entre as subespécies. A localização geográfica desses híbridos sugere uma possível zona híbrida. Em geral, a evidência molecular apoia a segregação da subespécie odorata e da subespécie tuberosa, com fluxo de gene limitado entre elas. © Copyright 2005 by the American Society of Plant Taxonomists.

 

Lin, J.T., Connelly, M.B., Amolo, C., Otani, S., Yaver, D.S.
"Global transcriptional response of Bacillus subtilis to treatment with subinhibitory concentrations of antibiotics that inhibit protein synthesis"
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49 (5), pp. 1915-1926. (2005)

Resumo

Os padrões globais de expressão de gene do Bacillus subtilis em resposta às concentrações subinibidoras de inibidores da síntese de proteína (cloranfenicol, eritromicina e gentamicina) foram estudados por meio da análise do microarranjo de DNA. As culturas do B. subtilis foram tratadas com concentrações subinibidoras de inibidores da síntese de proteína por 5, 15, 30 e 60 minutos, e os padrões transcricionais foram medidos todo o tempo. Três importantes classes de genes foram afetadas pelos inibidores da síntese de proteína: transporte da codificação de genes/proteínas de ligação, genes envolvidos na síntese de proteína, e genes envolvidos no metabolismo de carboidratos e moléculas relacionadas. Padrões de expressão semelhantes de algumas classes de genes foram observados devido ao tratamento com cloranfenicol (0,4x MIC) ou eritromicina (0,5x MIC), enquanto os padrões de expressão das células tratadas com gentamicina foram distintos. A expressão de genes envolvida no metabolismo de aminoácidos foi alterada pelo tratamento com cloranfenicol e eritromicina, mas não pelo tratamento com gentamicina. Os genes de choque térmico foram induzidos pela gentamicina, mas reprimidos pelo cloranfenicol. Outros genes induzidos pelos inibidores da síntese de proteína incluíram as proteínas semelhantes às transportadoras ABC de codificação do operon yheIH, com similaridade de proteínas de efluxo multidrogas, e os homólogos de codificação do operon ysbAB do LrgAB, que funcionam como inibidores da clivagem da parede celular (atividade da hidrolase murein) e transmitem a tolerância à penicilina no Staphylococcus aureus. Copyright © 2005, American Society for Microbiology. Todos os direitos reservados.

 

Rey, M.W., Ramaiya, P., Nelson, B.A., Brody-Karpin, S.D., Zaretsky, E.J., Tang, M., Lopez de Leon, A., Xiang, H., Gusti, V., Clausen, I.G., Olsen, P.B., Rasmussen, M.D., Andersen, J.T., Jørgensen, P.L., Larsen, T.S., Sorokin, A., Bolotin, A., Lapidus, A., Galleron, N., Ehrlich, S.D., Berka, R.M.
"Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species."
Genome biology, 5 (10), pp. R77. (2004)

Resumo

INTRODUÇÃO: o Bacillus licheniformis é uma bactéria Gram positiva existente no solo. Ele forma esporos e é usado na indústria de biotecnologia para fabricar enzimas, antibióticos, bioquímicos e produtos de consumo. Essa espécie tem parentesco próximo com o modelo bem estudado do organismo Bacillus subtilis, e produz uma variedade de enzimas extracelulares que podem contribuir para a reciclagem dos nutrientes na natureza. RESULTADOS: determinou-se a sequência completa do nucleotídeo do genoma ATCC 14580 do B. licheniformis, que é composto por um cromossomo circular de 4.222.336 pares de base (bp) contendo 4.208 genes de codificação de proteína previstos, com um tamanho médio de 873 bp, sete operons rRNA e 72 genes tRNA. O cromossomo do B. licheniformis contém grandes regiões que são colineares com os genomas do B. subtilis e do Bacillus halodurans, e aproximadamente 80% das sequências de codificação prevista do B. licheniformis têm ortólogos B. subtilis. CONCLUSÕES: apesar das inconfundíveis similaridades organizacionais entre os genomas do B. licheniformis e do B. subtilis, há diferenças notáveis nos números e locais dos prófagos, elementos transponíveis e algumas enzimas extracelulares e operons de via metabólica secundária que distinguem essas espécies. Essas diferenças incluem uma região de mais de 80 kilobases (kb) que compõem um agrupamento de genes de policetídeo sintase e um segundo operon de 38 kb que codifica as enzimas da plipastatin sintase ausentes no genoma do B. licheniformis. A disponibilidade de uma sequência completa do genoma para o B. licheniformis deveria facilitar o desenvolvimento e a construção de cepas industriais melhoradas e permitir a genômica comparativa e estudos evolutivos neste grupo de Bacillaceae.

 

Martinez, D., Larrondo, L.F., Putnam, N., Sollewijn Gelpke, M.D., Huang, K., Chapman, J., Helfenbein, K.G., Ramaiya, P., Detter, J.C., Larimer, F., Coutinho, P.M., Henrissat, B., Berka, R., Cullen, D., Rokhsar, D.
"Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78"
Nature Biotechnology, 22 (6), pp. 695-700. (2004)

Resumo

O fungo xilófago branco degrada com eficácia a lignina, um polímero aromático complexo da madeira que está entre os materiais naturais mais abundantes na Terra. Esses fungos usam enzimas oxidativas extracelulares que também são capazes de transformar compostos aromáticos relacionados em contaminantes explosivos, pesticidas e resíduos tóxicos. Fizemos o sequenciamento de 30 milhões de pares de base do genoma da cepa RP78 do Phanerochaete chrysosporium usando uma abordagem de Shotgun do genoma inteiro. O genoma do P. chrysosporium revela uma impressionante variedade de enzimas oxidases, peroxidases e hidrolíticas secretadas de codificação de genes que cooperam na decomposição da madeira. A análise dos dados do genoma melhorará a nossa compreensão da degradação da lignocelulose, um processo fundamental no ciclo global do carbono, e fornecerá uma estrutura para o maior desenvolvimento de bioprocessos para utilização de biomassa, degradação de organopoluentes e branqueamento de fibras. Esse genoma fornece uma sequência provisória de alta qualidade de um basidiomiceto, um importante filo fúngico que inclui relevantes patógenos de plantas e animais.

 

Hansen, E.H., Schembri, M.A., Klemm, P., Schäfer, T., Molin, S., Gram, L.
"Elucidation of the Antibacterial Mechanism of the Curvularia Haloperoxidase System by DNA Microarray Profiling"
Applied and Environmental Microbiology, 70 (3), pp. 1749-1757. (2004)

Resumo

Um novo sistema enzimático antimicrobiano, o sistema Curvularia haloperoxidase, foi examinado com o objetivo de esclarecer seu mecanismo de ação antibacteriano. A cepa MG1655 do Escherichia foi estressada com concentrações subletais do sistema da enzima, causando a detenção provisória do crescimento. A expressão de genes alterados na exposição ao sistema Curvularia haloperoxidase foi analisada por meio do uso de microarranjos de DNA. Apenas um número limitado de genes foi envolvido na resposta ao sistema Curpularia haloperoxidase. Entre os genes induzidos estavam o ibpA e o ibpB, que codificam pequenas proteínas de choque térmico, um agrupamento de seis genes (b0301–b0306) de função desconhecida e, por fim, o cpxP, um membro da via de Cpx. Os mutantes knockout foram construídos com exclusões no b0301–b0306, cpxP e cpxARP, respectivamente. Apenas o mutante sem cpxARP foi significativamente mais sensível ao sistema enzimático do que o tipo selvagem. Nossos resultados demonstram que a tecnologia de microarranjo de DNA não pode ser usada como a única técnica para investigar os mecanismos de ação dos novos compostos antimicrobianos. Porém, ao combinar a análise do microarranjo de DNA com a criação subsequente de mutantes knockout, conseguimos apontar uma das respostas específicas do E. coli, ou seja, a via de Cpx, que é importante para administrar a resposta ao estresse do sistema Curvularia haloperoxidase.

R.M. Berka; B.A. Nelson; E.J. Zaretsky; W.T. Yoder; M.W. Rey.
"Genomics of Fusarium venenatum: an alternative fungal host for making enzymes". 
In, Applied Mycology & Biotechnology, Vol. 4, Fungal Genomics (Arora, D.K. and Khachatourians, G.G., eds.) Elsevier Science, Amsterdam (2003)

Resumo

O Fusarium venenatum A3/5 (anteriormente conhecido como F. graminearum Schwabe A3/5) tem sido usado desde 1985 como a fonte comercial da micropoteína Quorn™, uma forma processada de micélios fúngicos aplicados em vários alimentos humanos para simular pedaços de frango ou bife.  A aprovação regulatória do organismo para consumo humano o tornou um candidato atraente a ser considerado como um hospedeiro para a produção de enzimas de grau industrial e de grau alimentício. Os sistemas para a transformação e manipulação genética das células do F. venenatum foram desenvolvidos junto com vários promotores sólidos e marcadores selecionáveis para a introdução e expressão de genes heterólogos.  O marketing recente de uma xilanase heteróloga e de uma tripsina fúngica forneceu uma "prova de conceito" para o F. venenatum como uma alternativa útil para hospedeiros fúngicos tradicionais, como o Aspergillus niger ou o A. oryzae.  Porém, comparado aos últimos organismos e aos fungos do modelo bem estudado, como o Neurospora crassa e o A. nidulans, as informações relacionadas à genômica do F. venenatum são inadequadas.  Este capítulo fornece uma das primeiras visões gerais das informações genômicas do F. venenatum baseadas em uma compilação de etiquetas de sequência expressas e sequências de gene cromossômico para iniciar o impulso para os esforços mais abrangentes de sequenciamento genômico.

 

R.M. Berka; X. Cui; C.Yanofsky.
"Genome-wide transcriptional changes associated with genetic alterations and nutritional supplementation affecting tryptophan metabolism in Bacillus subtilis."
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 100, 5682-5687 (2003)

Resumo

Os microarranjos de DNA que compreendem 95% dos QLAs de codificação de proteína anotados do Bacillus subtilis foram implantados para gerar uma série de snapshots das alterações transcricionais de todo o genoma, que ocorrem quando as células são cultivadas sob várias condições das quais se espera aumentar ou diminuir a transcrição do segmento do operon do trp do supraoperon aromático. Foram feitas comparações de padrões de expressão globais entre as células cultivadas na presença de ácido acrílico indol, um inibidor específico do carregamento de tRNATrp; células deficientes na expressão do gene mtrB, que codifica a proteína regulatória negativa ativada pelo triptofano, TRAP; células WT cultivadas na presença ou ausência de dois ou três aminoácidos aromáticos; e células que abrigam uma mutação de tripofanil tRNA sintetase, que confere o crescimento dependente de tripofanil sensível a temperatura. Nossas descobertas validam as respostas esperadas dos genes biossintéticos do tripofano e as inter-relações regulatórias supostas entre os genes nas diferentes vias do aminoácido aromático e na via biossintética da histidina. Usando uma combinação de métodos estatísticos supervisionados e não supervisionados, identificamos 100 genes com perfis de expressão estreitamente ligados àqueles dos genes no operon do trp. Essa descoberta sugere que a expressão desses genes é influenciada direta ou indiretamente pelos eventos regulatórios que afetam ou são uma consequência do metabolismo alterado do tripofano.

 

C. Workman; L.J. Jensen; H. Jarmer; R. Berka; L. Gautier; H.H. Saxild; C. Nielsen; S. Brunak; S. Knudsen. 
"Methods to reduce variability in DNA microarray experiments."
Genome Biology, 3, 0048.1-0048.16 (2002)

Resumo

Os dados do microarranjo estão sujeitos a vários fatores de variação, dos quais os fatores biológicos são de interesse, enquanto a maioria dos outros são apenas confundimentos. Um trabalho recente identificou fatores de variação sistemáticos que dependem da intensidade e da não linearidade na natureza. Os fatores de variação sistemáticos não estão limitados às propriedades de diferenciação dos corantes de cianina Cy5 e Cy3, conforme observado nos arranjos de cDNA, mas são casos gerais do microarranjo de oligonucleotídeo (Affymetrix GeneChips) e dados do microarranjo de cDNA. As técnicas de normalização atuais são lineares em sua maioria e, portanto, incapazes de corrigir totalmente esses impactos.  Apresentamos aqui um método não linear, simples e eficiente de normalização usando splines cúbicas e análise de distribuição de sinais de arranjo. Esses métodos foram comparados favoravelmente à normalização usando a regressão linear-local eficiente (LOWESS). A aplicação desses métodos aos arranjos de oligonucleotídeos reduziram o erro relativo entre duplicações em até 5–10% em relação ao método de normalização global padrão. A aplicação aos arranjos de cDNA mostraram melhorias em relação ao método padrão e à normalização Cy3–Cy5 baseada na duplicação da inversão de corantes. Além disso, um conjunto conhecido de genes regulados de forma diferente obteve uma classificação mais alta no teste t. Na tecnologia da Affymetrix ou do cDNA, o viés dependente de sinal foi mais de dez vezes maior do que os efeitos observados em print-tip ou spatial.  A normalização dependente de intensidade é importante para os dados do arranjo do cDNA e arranjo oligonucleotídeo de alta densidade. Os dois métodos baseados em spline e regressão descritos aqui tiveram um melhor desempenho do que os métodos lineares existentes quando avaliados na variabilidade dos arranjos duplicados. A normalização da inversão de corantes foi menos eficaz na normalização Cy3–Cy5 do que nos métodos baseados em spline ou regressão.

 

R.M. Berka; J. Hahn; I. Draskovic; M. Persuh; X. Cui; A. Sloma; W. Widner; D. Dubnau.
"Microarrray analysis of the Bacillus subtilis K-state: genome-wide expression changes induced by ComK." 
Mol. Microbiol., 43, 1331-1345 (2002)

Resumo

No Bacillus subtilis, o fator de transcrição de competência ComK ativa sua própria transcrição, bem como a transcrição dos genes que codificam as proteínas de transporte do DNA. O ComK está expresso em aproximadamente 10% das células em uma cultura cultivada para competência. Usando microarranjos de DNA que representam 95% dos quadros de leitura aberta da codificação de proteína no B. subtilis, comparamos os perfis de expressão do tipo selvagem e cepas comK, bem como de um mutante mecA (que produz ComK ativo em todas as células da população) e um mutante duplo comK mecA. Nessas comparações, identificamos pelo menos 165 genes que são regulados de forma ascendente pelo ComK e relativamente poucos são regulados de forma descendente. O uso de fusões repórteres tem confirmado esses resultados para vários genes. Muitos dos genes regulados por ComK são organizados em agrupamentos ou operons, e 23 desses agrupamentos são precedidos pelos motivos do promotor ComK box aparente. Além daqueles necessários para a absorção de DNA, outros genes que são regulados de forma ascendente na presença do ComK estão provavelmente envolvidos no reparo do DNA e na absorção e utilização de fontes nutricionais. Neste e em trabalhos anteriores, concluímos que a regra do ComK define um estado de detenção de crescimento, diferente da esporulação, da qual a competência para transformação genética é apenas uma característica notável. Sugerimos que essa seja uma adaptação única ao estresse e que seja denominada 'estado K'.

 

H. Jarmer; R. Berka; S. Knudsen; H.H. Saxild.
"Transcriptome analysis documents induced competence of Bacillus subtilis during nitrogen limiting conditions."
FEMS Microbiol. Lett., 206, 197-200 (2002)

Resumo

Os microarranjos de DNA foram usados para analisar as alterações na expressão do gene na cepa 168 do Bacillus subtilis quando as condições de cultivo na limitação de nitrogênio (glutamato) e no excesso de nitrogênio (amônia + glutamato) foram comparadas. Entre mais de 100 genes que foram significativamente induzidos durante a inanição de nitrogênio, detectamos as unidades de transcrição comG, comF, comE, nin-nucA e comK junto com recA. O DNA foi adicionado à cultura de B. subtilis no meio mínimo com o glutamato como a única fonte de nitrogênio, sendo demonstrado que as células eram competentes. Com base nessas observações, propomos uma simplificação dos procedimentos de uma etapa desenvolvidos anteriormente para a cepa 168 do B. subtilis.