Faber, C., Hobley, T.J., Mollerup, J., Thomas, O.R.T., Kaasgaard, S.G.
"Factors affecting the solubility of Bacillus halmapalus α-amylase"
Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 47 (6), pp. 1007-1017. (2008)

Resumo

Foi conduzido um estudo detalhado da solubilidade da α-amilase recombinante de Bacillus halmapalus. Uma preparação semipurificada a partir de uma cristalização em massa foi escolhida, contendo seis isoformas com valores de pI entre 5,5 e 6,1. A solubilidade foi fortemente afetada pelo pH e poderia ser reduzida aproximadamente 200 vezes a pH 6, em comparação com pH 10, deixando apenas 0,1 mg/mL em solução. A solubilidade também pode ser drasticamente manipulada usando-se sais. A escolha dos ânions foi mais importante do que dos cátions, e a menor solubilidade foi encontrada usando-se sulfato de sódio. Para os ânions, a solubilidade seguiu a ordem esperada da série Hofmeister, no entanto, um comportamento mais complexo foi identificado para os cátions. Com a exceção do lítio, sua eficiência para influenciar a solubilidade foi revertida para o que era esperado. A polidispersidade da solução foi reduzida com a adição de sal, e as medidas do potencial zeta indicaram uma mudança em pI causada pelo lítio. Possíveis explicações para as observações são discutidas, estendendo a nossa compreensão atual de como os sais afetam a solubilidade das proteínas, uma explicação que até agora é baseada principalmente em experimentos com lisozima. © 2007 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Sonesson, A.W., Callisen, T.H., Brismar, H., Elofsson, U.M.
"Adsorption and activity of Thermomyces lanuginosus lipase on hydrophobic and hydrophilic surfaces measured with dual polarization interferometry (DPI) and confocal microscopy"
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 61 (2), pp. 208-215. (2008)


Resumo

A adsorção e atividade da Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) foi medida com interferometria de polarização dupla (DPI, na sua sigla em inglês) e microscopia confocal em uma superfície hidrofílica e hidrofóbica. Nas isotermas de adsorção, ficou evidente que a TLL apresentava maior afinidade para a superfície hidrofóbica e adsorvido a uma quantidade adsorvida maior (1,90 mg/m2) em comparação com a superfície hidrofílica (1,40–1,50 mg/m2). A espessura da camada adsorvida foi constante (~3,5 nm) em ambas as superfícies em uma quantidade adsorvida > 1,0 mg/m2, mas diminuiu na superfície hidrofílica com cobertura de superfície inferior, o que pode ser explicado pelo desdobramento parcial da estrutura da TLL. No entanto, uma dependência linear do índice de refração da camada adsorvida na quantidade adsorvida da TLL em superfícies C18 indicou que a estrutura da TLL era similar à cobertura da superfície baixa e alta. A atividade da TLL adsorvida foi medida em relação ao diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) em solução, que após a atividade da lipase formou um produto fluorescente. O aumento da intensidade da fluorescência superficial foi medido em um microscópio confocal em função do tempo após a adsorção da lipase. Ficou evidente que a TLL era mais ativa na superfície hidrofílica, o que sugeriu que uma fração maior de moléculas da TLL adsorvida estava orientada para o local ativo de frente para a solução em comparação com a superfície hidrofóbica. Além disso, a maior parte da atividade permaneceu quando a cobertura da superfície da TLL diminuiu. Relatórios anteriores sobre a mobilidade da superfície da TLL nas mesmas superfícies descobriram que a difusão lateral foi maior em superfícies hidrofílicas e na cobertura baixa da superfície da TLL. Portanto, uma alta mobilidade lateral pode levar a um tempo de exposição mais longo do local ativo para a solução, aumentando assim a atividade contra um substrato solúvel em água. © 2007 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Roca, M., De Maria, L., Wodak, S.J., Moliner, V., Tuñón, I., Giraldo, J.
"Coupling of the guanosine glycosidic bond conformation and the ribonucleotide cleavage reaction: Implications for barnase catalysis"
Proteins: Structure, Function and Genetics, 70 (2), pp. 415-428. (2008)

Resumo

Para examinar a possível relação das conformações de glicoforina A (GpA) dependente de guanina com a clivagem de ribonucleotídeos, dois cálculos de potencial de força média (PMF, na sua sigla em inglês) foram realizados em solução aquosa. No primeiro cálculo, o ângulo de guanosina glicosídica (Gχ) foi utilizado como coordenada de reação e foram realizadas computações em duas espécies iónicas de GpA: guanosina ribose O2' protonada (neutra) ou desprotonada (carregada negativamente). Perfis energéticos similares apresentando dois mínimos correspondentes às regiões anti e sin Gχ foram obtidos para as duas formas iônicas. Para ambas as formas, a anticonformação é mais estável do que a sin, e as barreiras de ~4 kcal/mol foram obtidas para a transição anti → sin. A análise estrutural mostrou uma sensibilidade notável da fração de fosfato à conformação do ângulo Gχ, sugerindo uma possível conexão entre essa conformação e o mecanismo da clivagem de ribonucleotídeos. Essa hipótese foi confirmada pelos segundos cálculos de PMF, para os quais a distância O2'-P para a GpA desprotonada foi utilizada como coordenada de reação. Os cálculos foram realizados a partir de dois pontos de partida selecionados: os anti e sin mínimos determinados no primeiro estudo de PMF da guanosina ribose O2' desidratada. As simulações revelaram que o ataque de O2′ ao longo de sin Gχ foi mais favorável do que ao longo de anti Gχ: energeticamente, obtiveram-se barreiras significativamente mais baixas na conformação sin do que na anti para a formação de ligações O-P; estruturalmente, uma menor distância inicial de O2'-P e uma orientação melhor adaptada para um ataque em linha foi observada na conformação sin em relação à anti. Esses resultados são consistentes com a conformação cataliticamente competente do complexo barnase-ribonucleotídeo, que requer uma conformação sin de guanina do substrato para permitir a abstração do próton H2′ de ribose pela base geral Glu73, sugerindo assim um acoplamento entre a conformação do substrato reativo e a estrutura e o mecanismo da enzima. © 2007 Wiley-Liss, Inc.


Sonesson, A.W., Blom, H., Hassler, K., Elofsson, U.M., Callisen, T.H., Widengren, J., Brismar, H.
"Protein-surfactant interactions at hydrophobic interfaces studied with total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS)"
Journal of Colloid and Interface Science, 317 (2), pp. 449-457. (2008)

Resumo

O objetivo deste estudo foi estudar a dinâmica de proteínas perto de superfícies sólidas na presença ou ausência de surfactantes concorrentes por meio de espectroscopia de correlação de fluorescência de reflexão interna total (TIR-FCS, na sua sigla em inglês). Foram estudadas duas proteínas diferentes, a albumina do soro bovino (BSA) e a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL). Utilizou-se uma composição de surfactante não iônico/aniônico (C12E6/LAS) para imitar uma formulação de detergente, e as superfícies utilizadas eram vidro terminado em C18. Verificou-se que, com o aumento das concentrações de surfactantes, o prazo na função de autocorrelação (ACF, na sua sigla em inglês) que representa a ligação à superfície diminuiu. Isso sugeriu que as proteínas foram destruídas fora da superfície hidrofóbica pelo surfactante. Ao ajustar a ACF medida a um modelo para a cinética da superfície, verificou-se que com a concentração aumentada de C12E6/LAS, a taxa de interação da superfície aumentou para ambas as proteínas. Sob estas condições experimentais isso significou que o tempo que a proteína ficou ligada à superfície diminuiu. Em 10 μM C12E6/LAS, a interação da superfície não era visível para BSA, enquanto que ainda era distinguível na ACF para a TLL. Isso indicou que a TLL tinha uma afinidade maior do que a BSA com a superfície C18. O estudo mostrou que a TIR-FCS fornece uma ferramenta útil para quantificar o efeito surfactante sobre a adsorção de proteínas. © 2007 Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.


Rodriguez-Larrea, D., Ibarra-Molero, B., De Maria, L., Borchert, T.V., Sanchez-Ruiz, J.M.
"Beyond Lumry-Eyring: An unexpected pattern of operational reversibility/irreversibility in protein denaturation"
Proteins: Structure, Function and Genetics, 70 (1), pp. 19-24. (2008)

Resumo

Descobrimos que, ao contrário da intuição ingênua, o grau de reversibilidade operacional na desnaturação térmica da lipase da Thermomyces lanuginosa (uma enzima industrial importante) em soluções de ureia é máximo quando a proteína é aquecida vários graus acima do fim da transição de desnaturação induzida por temperatura. Após o resfriamento até a temperatura ambiente, a proteína parece atingir um estado com atividade enzimática semelhante ao estado nativo inicial, mas com maior temperatura de desnaturação e comportamento radicalmente diferente em termos de suscetibilidade a desnaturação irreversível. Esses resultados mostram que os padrões de reversibilidade/irreversibilidade operacional na desnaturação de proteínas podem ser mais complexos do que a classificação de duas situações (reversível versus irreversível), muitas vezes aceita como óbvia. Além disso, eles são consistentes com a possibilidade de existência de diferentes estados nativos ou semelhantes a estados nativos separados por barreiras cinéticas altas sob condições nativas e sugerem procedimentos experimentais para alcançar e estudar esses estados nativos "alternativos". © 2007 Wiley-Liss, Inc.

 

Jauffred, L., Callisen, T.H., Oddershede, L.B.
Visco-elastic membrane tethers extracted from Escherichia coli by optical tweezers
Biophysical Journal, 93 (11), pp. 4068-4075. (2007)

Resumo

Tirantes foram criados entre uma bactéria Escherichia coli viva e uma esfera conectando, de maneira não específica, a esfera à membrana externa e puxando-a usando pinças ópticas. Após a liberação, a esfera retornou à bactéria, mostrando assim a existência de um tirante elástico entre a esfera e a bactéria. Esses tirantes podem ter dezenas de microns de comprimento, várias vezes o comprimento da bactéria. Ao usar mutantes que expressam diferentes partes da estrutura da membrana externa, mostramos que um lipopolissacarídeo do núcleo intacto é uma condição necessária para a formação do tirante, independentemente de as esferas serem poliestireno não revestido ou esferas revestidas com lectina. Uma caracterização física dos tirantes foi realizada produzindo relações de força-extensão dos tirantes viscoelásticos: para os primeiros tirantes de extração, uma mola constante de 10-12 pN/μm descreve a elasticidade viscoelástica, para as extrações subsequentes, a mola constante diminui para 6–7 pN/μm, e as escalas de tempo de relaxamento típicas de centenas de segundos são observadas. Estudos sobre a estabilidade dos tirantes na presença de proteases, lipases e amilases nos levam a propor que o tirante extraído seja composto principalmente de lipopolissacarídeo assimétrico contendo duas camadas da membrana externa. Esse mecanismo de conexão de tirante não específico pode ser importante no início da adesão bacteriana. © 2007 by the Biophysical Society.


Bagger, H.L., Øgendal, L.H., Westh, P.
"Solute effects on the irreversible aggregation of serum albumin"
Biophysical Chemistry, 130 (1-2), pp. 17-25. (2007)

Resumo

O estresse térmico na albumina do soro bovino (BSA) promove a agregação proteica através da formação de folhas β intermoleculares. Utilizamos a dispersão de luz e a cromatografia para estudar os efeitos de (< 1 M) Na2SO4, NaSCN, sacarose, sorbitol e ureia na taxa de agregação térmica. Ambos os sais foram inibidores fortes da agregação de BSA e reduziram tanto o tamanho quanto o número (concentração) de partículas agregadas em comparação com solutos não iônicos (ou tampão puro). Portanto, os sais parecem suprimir tanto a taxa de nucleação quanto a taxa de crescimento. Os aditivos não eletrólitos reduziram a taxa de agregação inicial (em comparação com o tampão puro), mas não limitaram significativamente a extensão da agregação em amostras eliminadas após 27 min de exposição ao calor (40–50% de agregação em todas as amostras). No entanto, os aditivos não eletrólitos modificaram o processo de agregação, na medida em que produziram consistentemente agregados menores, mas mais concentrados do que o tampão puro. Os resultados são discutidos juntamente com as teorias das linhas de ligação e do estado de transição. Nessa estrutura, a taxa do processo de agregação é governada pelo equilíbrio entre um estado desnaturado termicamente (D) e o estado de transição D≠. Assim, o efeito de um soluto depende de suas interações preferenciais com D e D≠, respectivamente. Os resultados atuais não mostram nenhuma correlação entre as interações preferenciais dos solutos com BSA nativo e seu efeito na taxa de agregação. Isso sugere que as interações não específicas "tipo Hofmeister", que se dimensionam com a área de superfície acessível ao solvente, são de menor importância. Em vez disso, sugere-se que a supressão induzida por sal da agregação depende da modulação de forças eletrostáticas específicas no estado D≠. © 2007 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.


Nordkvist, M., Nielsen, P.M., Villadsen, J.

"Oxidation of lactose to lactobionic acid by a Microdochium nivale carbohydrate oxidase: Kinetics and operational stability"
Biotechnology and Bioengineering, 97 (4), pp. 694-707. (2007)

Resumo

Foi estudada a oxidação da lactose em ácido lactobiônico por uma enzima carboidrato oxidase de Microdochium nivale. O valor de Km para lactose, obtido por um ensaio enzimático tradicional, foi de 0,066 mM a pH de 6,4 e 38 °C. O efeito do oxigênio sobre a taxa de reação enzimática, bem como a estabilidade operacional da enzima, foi estudado realizando-se reações a pH e temperatura constantes em um reator de tanque agitado. A catalase foi incluída em todas as reações para evitar a inibição e a desativação da oxidase por peróxido de hidrogênio. A pH de 6,4 e 38 °C, o Km para oxigênio foi de 0,97 mM, enquanto que a constante de taxa catalítica, kcat, foi de 94 s-1. Além disso, descobrimos que a estabilidade operacional da oxidase era dependente do tipo de base utilizada para a neutralização do ácido produzido. Portanto, quando se utilizou 2 M NaOH para a neutralização de um meio de reação contendo tampão de fosfato 50 mM, observou-se desativação significativa da oxidase. Também descobrimos que a oxidase foi protegida contra a desativação por base com altas concentrações de lactose. Um modelo simples é proposto para explicar os resultados obtidos. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.


Bagger, H.L., Hoffmann, S.V., Fuglsang, C.C., Westh, P.
"Glycoprotein-surfactant interactions: A calorimetric and spectroscopic investigation of the phytase-SDS system"
Biophysical Chemistry, 129 (2-3), pp. 251-258. (2007)

Resumo

Foram investigadas as interações de dodecilsulfato de sódio (SDS) e duas glicovariantes da enzima fitase de Peniophora lycii. Uma variante (Phy) foi fortemente glicosilada, enquanto a outra (dgPhy) foi desglosilada enzimaticamente. Os efeitos a 24 °C da titulação de SDS para Phy e dgPhy foram estudados por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e espectroscopia de dicroísmo circular de radiação sincrotrônica (SRCD). Foram utilizadas comparações de resultados para as duas variantes para elucidar as inter-relações com o surfactante glicano. Os espectros de dicroísmo circular sugeriram que os estados nativo e desnaturado de SDS das duas variantes eram mutuamente semelhantes e, portanto, que o processo de desnaturação era estruturalmente equivalente para as duas glicovariantes. O estado desnaturado estava longe de ser totalmente desdobrado e, provavelmente, manteve um conteúdo substancial da estrutura semelhante ao estado nativo. Além disso, verificou-se que os glicanos trouxeram apenas um pequeno aumento da resistência à desnaturação induzida por SDS. A concentração de SDS necessária para desnaturar a metade das moléculas de proteína diferiu menos de 1 mM para as duas variantes. A afinidade com o SDS de ambas as variantes foi excepcionalmente baixa. A quantidade de SDS ligado (p/p) em diferentes estágios da isoterma de ligação foi 3-10 vezes menor que a relatada para as proteínas globulares mais investigadas anteriormente. A análise da afinidade relativa das porções de glicano e peptídeo sugeriu que os carboidratos ligam muito menos surfactantes. Na saturação, os glicanos adsorveram cerca de metade da quantidade de SDS (em g/g) como a porção peptídica de Phy e cerca de cinco vezes menos que as proteínas médias. © 2007 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.


Sonesson, A.W., Elofsson, U.M., Callisen, T.H., Brismar, H.
"Tracking single lipase molecules on a trimyristin substrate surface using quantum dots"
Langmuir, 23 (16), pp. 8352-8356. (2007)

Resumo

A mobilidade de moléculas únicas de lipase foi analisada usando rastreamento de molécula única na superfície de um substrato de trimistina. Conseguiu-se isso através da conjugação de lipases com pontos quânticos e imagens em superfícies de trimiristina revestidas por rotação por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Foram coletadas séries de imagens de moléculas únicas de lipase, e o coeficiente de difusão foi quantificado pela análise do deslocamento quadrático médio das trajetórias calculadas. Durante as condições sem fluxo, o coeficiente de difusão da lipase foi (8,0 ±5,0) × 10–10 cm2/s. As trajetórias tiveram uma aparência de "esfera em uma corda", com a molécula de lipase restrita em certas regiões da superfície e depois migrando para outra região em que a difusão restrita continuou. Isso deu origem a agrupamentos nas trajetórias. Quando um fluxo foi aplicado ao sistema, a distância total e o comprimento médio entre os agrupamentos aumentaram, mas a difusão restrita nas regiões do agrupamento não foi afetada. Isso pode ser explicado pela lipase que opera em dois modos diferentes na superfície. Nas regiões de agrupamento, a lipase é provavelmente orientada com o local ativo para a superfície e hidrolisa o substrato. Entre essas regiões, propõe-se um processo de difusão onde a lipase está em contato com a superfície, mas afetada pelo fluxo externo. © 2007 American Chemical Society.


Nordkvist, M., Nielsen, P.M., Villadsen, J.
"Oxidation of lactose to lactobionic acid by a Microdochium nivale carbohydrate oxidase: Kinetics and operational stability"
Biotechnology and Bioengineering, 97 (4), pp. 694-707. (2007)

Resumo

Foi estudada a oxidação da lactose em ácido lactobiônico por uma enzima carboidrato oxidase de Microdochium nivale. O valor de Km para lactose, obtido por um ensaio enzimático tradicional, foi de 0,066 mM a pH de 6,4 e 38 °C. O efeito do oxigênio sobre a taxa de reação enzimática, bem como a estabilidade operacional da enzima, foi estudado realizando-se reações a pH e temperatura constantes em um reator de tanque agitado. A catalase foi incluída em todas as reações para evitar a inibição e a desativação da oxidase por peróxido de hidrogênio. A pH de 6,4 e 38 °C, o Km para oxigênio foi de 0,97 mM, enquanto que a constante de taxa catalítica, kcat, foi de 94 s-1. Além disso, descobrimos que a estabilidade operacional da oxidase era dependente do tipo de base utilizada para a neutralização do ácido produzido. Portanto, quando se utilizou 2 M NaOH para a neutralização de um meio de reação contendo tampão de fosfato 50 mM, observou-se desativação significativa da oxidase. Também descobrimos que a oxidase foi protegida contra a desativação por base com altas concentrações de lactose. Um modelo simples é proposto para explicar os resultados obtidos. © 2006 Wiley Periodicals, Inc.


Faber, C., Hobley, T.J., Mollerup, J., Thomas, O.R.T., Kaasgaard, S.G.
"Study of the solubility of a modified bacillus licheniformis α-amylase around the isoelectric point"
Journal of Chemical and Engineering Data, 52 (3), pp. 707-713. (2007)

Resumo

A solubilidade de uma α-amilase de Bacillus licheniformis recombinante modificada (mBLA) foi estudada por cristalização em lotes. Escolheu-se uma preparação semipura contendo cinco isoformas com valores de pI de 6 a 7,3 (média ponderada de 6,6). Pequenas quantidades (<1%) de impurezas de proteína também estavam presentes. A solubilidade foi estudada na faixa de pH de 6 a 8. A solubilidade mais baixa sem sais adicionados foi de 60 mg · mL-1 a pH 7. A adição de sais de sódio de 0,1 mol·L-1 de nitrato, sulfato e tiocianato apresentou um pequeno efeito sobre a solubilidade. No entanto, a solubilidade foi reduzida significativamente ao se adicionar 0,5 mol-L-1 de sulfato de sódio em todos os valores de pH e aumentou com 0,5 mol-L-1 de tiocianato de sódio a pH 7 e pH 8. O efeito dos ânions sobre a solubilidade da α-amilase seguiu a série Hofmeister, e apenas evidências fracas de reversão foram vistas abaixo do ponto isoelétrico. Os cátions tiveram pouco efeito sobre a solubilidade. O sinal e a magnitude do potencial de α-amilase ζ foram determinados na presença e na ausência de sal de 0,1 mol-L-1. Qualitativamente, o potencial ζ previu corretamente a influência dos diferentes sais na solubilidade da mBLA. © 2007 American Chemical Society.


Nielsen, A.D., Borch, K., Westh, P.
"Thermal stability of Humicola insolens cutinase in aqueous SDS"
Journal of Physical Chemistry B, 111 (11), pp. 2941-2947. (2007)

Resumo

A cutinase de Humicola insolens (HiC) demonstrou anteriormente se ligar a quantidades anormalmente baixas do surfactante aniônico de dodecilsulfato de sódio (SDS). No estudo atual, aplicamos a calorimetria de varredura e titulação para investigar as possíveis relações entre essa interação fraca e o efeito do SDS no equilíbrio e na estabilidade cinética da HiC. Os resultados são apresentados em um "diagrama de estado", que especifica a forma estável da proteína em função da temperatura e da concentração de SDS. Em comparação a outras proteínas, a estabilidade de equilíbrio HiC é fortemente diminuída por SDS. Para concentrações baixas de SDS (razão molar SDS:HiC, RM < 8), essa característica também é encontrada para a agregação térmica controlada cineticamente da proteína. Em uma RM mais alta, no entanto, o SDS estabiliza-se visivelmente contra a agregação irreversível. Sugerimos que isso depende da repulsão eletrostática dos complexos HiC-SDS cada vez mais carregados negativamente. A interpretação combinada de dados calorimétricos e dados de ligação permitiu o cálculo das mudanças na capacidade de entalpia e calor para a associação de HiC e SDS perto do ponto de saturação. A última função foi de cerca de -410 J mol-1 K-1 ou similar à mudança de capacidade térmica para a formação de micelas (-470 J mol-1 K-1). Isso sugere que o SDS é hidratado de forma semelhante nas formas micelar e nas proteínas associadas. Os resultados são discutidos em termos da teoria de Wyman para equilíbrios vinculados. A análise quantitativa, ao longo destas linhas, sugere que o desdobramento térmico reversível da proteína se une com a ligação de 2-3 moléculas de SDS adicionais. Isso corresponde a um aumento de 15–20% no número de ligações. A teoria de Wyman também racionaliza as relações entre baixa afinidade e alta susceptibilidade observadas neste estudo. © 2007 American Chemical Society.


Bertram, H.C., Kristensen, M., Østdal, H., Baron, C.P., Young, J.F., Andersen, H.J.
"Does oxidation affect the water functionality of myofibrillar proteins?"
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55 (6), pp. 2342-2348. (2007)

Resumo

As propriedades de retenção de água das miofibrilas extraídas do músculo suíno e a hemoglobina adicionada com e sem exposição ao H2O2 foram caracterizadas usando a relaxometria de NMR T2 com prótons de campo baixo. Os efeitos do pH e da força iônica nas amostras foram investigados à medida que o pH foi ajustado para 5,4, 6,2 e 7,0 e a força iônica foi ajustada para 0,29, 0,46 e 0,71 M, respectivamente. A formação de ditirosina como medida de reticulação de proteínas oxidativas revelou um aumento significativo nas concentrações de ditirosina após a ativação de H2O2. A formação de ditirosina foi fortemente dependente do pH e aumentada com a diminuição do pH. Além disso, observou-se aumento dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico após a adição de H2O2, o que implica que a oxidação lipídica foi aprimorada, no entanto, com um padrão de oxidação diferente em comparação às proteínas miofibrilares. As medidas de relaxamento de NMR de campo baixo revelaram tempos de relaxamento T2 reduzidos após a ativação de H2O2, o que corresponde a uma redução da capacidade de retenção de água após a oxidação. No entanto, uma relação direta entre o grau de oxidação e o tempo de relaxamento T2 não foi observada com vários valores de pH e forças iônicas, e são necessários mais estudos para uma compreensão completa do efeito da oxidação na funcionalidade miofibrilar. © 2007 American Chemical Society.


Sonesson, A.W., Brismar, H., Callisen, T.H., Elofsson, U.M.
"Mobility of Thermomyces lanuginosus lipase on a trimyristin substrate surface"
Langmuir, 23 (5), pp. 2706-2713. (2007)

Resumo

Estudamos a mobilidade de lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) ativa e inativa em uma superfície de substrato de trimiristina revestida por centrifugação com recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP, na sua sigla em inglês) em uma configuração de microscopia confocal. Ao a fotodegradação de um ponto circular de TLL marcado com fluorescência, adsorvido em uma superfície de trimiristina lisa, tanto o coeficiente de difusão D quanto a fração móvel f podem ser quantificados. A FRAP foi realizada em superfícies com diferentes densidades superficiais de lipase e como função do tempo após a adsorção. Os dados mostraram que a mobilidade de TLL foi significativamente maior nas superfícies do substrato da trimiristina em comparação a nossos estudos anteriores sobre superfícies de modelo hidrofóbico. Para ambas as variantes de lipase, a difusão diminuiu para taxas semelhantes a densidade relativa alta de superfície de lipase, sugerindo que os efeitos de aglomeração são dominantes com uma maior quantidade adsorvida de lipase. No entanto, o coeficiente de difusão na diluição de superfície infinita extrapolada, D0, foi maior para TLL ativo em comparação ao inativo (D0 = 17,9 × 10–11 cm2/s versus D0 = 4,1 × 10–11 cm2/s, dados para o primeiro intervalo de tempo após adsorção). Além disso, a difusão diminuiu com o tempo após a adsorção, sendo mais evidente para TLL ativo. Explicamos os resultados por inibição do produto, isto é, que a acumulação de produtos de ácidos graxos carregados negativamente diminuiu a taxa de difusão das lipases ativas com o tempo. Isso foi confirmado por experimentos de adsorção sequencial, em que a quantidade adsorvida em condições de fluxo foi estudada como função do tempo após a adsorção. Uma segunda injeção de lipase levou a um aumento significativamente menor da quantidade adsorvida quando a superfície de trimiristina foi pré-tratada com TLL ativo em comparação ao pré-tratamento de TLL inativo. © 2007 American Chemical Society.


Xu, F., Ding, H. 
"A new kinetic model for heterogeneous (or spatially confined) enzymatic catalysis: Contributions from the fractal and jamming (overcrowding) effects"
Applied Catalysis A: General, 317 (1), pp. 70-81. (2007)

Resumo

A catálise heterogênea envolve catalisadores e reagentes separados em diferentes fases. Nesses sistemas, a interação entre o reagente e o catalisador pode ser bastante diferente de sua contrapartida homogênea, devido à peculiaridade dos processos de difusão e colisão molecular, restringida a espaços com dimensão inferior a três. A teoria fractal, desenvolvida para processos matemáticos, físicos, químicos e biológicos, com irregularidades e complexidades inerentes, pode ser aplicada à catálise heterogênea. Para melhor compreender as reações enzimáticas heterogêneas, uma cinética de Michaelis foi reformulada, depois de aplicar o formalismo fractal geral ao modelo clássico de reações enzimáticas homogêneas. Também foi estudado um efeito de "bloqueio" cinético causado pela superlotação de enzima/substrato em espaço confinado. O novo modelo cinético foi aplicado à hidrólise de celulose pela celobiohidrolase, um sistema biocatalítico heterogêneo representativo altamente fractal devido à forte adsorção superficial da enzima no substrato insolúvel, bem como ao mecanismo enzimático "processivo" unidimensional. A utilidade do modelo para estudo e aplicação de outras reações enzimáticas foram discutidas. © 2006 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.


Balashev, K., John DiNardo, N., Callisen, T.H., Svendsen, A., Bjørnholm, T.
"Atomic force microscope visualization of lipid bilayer degradation due to action of phospholipase A2 and Humicola lanuginosa lipase"
Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, 1768 (1), pp. 90-99. (2007)

Resumo

Uma aplicação importante da microscopia de força atômica (AFM, na sua sigla em inglês) de células líquidas é o estudo da estrutura e do comportamento enzimático em meios moleculares organizados que imitam sistemas in vivo. Neste estudo, demonstramos o uso de AFM como uma ferramenta para estudar a cinética de reações enzimáticas lipolíticas que ocorrem na superfície de uma bicamada lipídica suportada. Em particular, o curso do tempo da degradação de bicamadas lipídicas por fosfolipase A2 (PLA2) e Humicola lanuginosa lipase (HLL) foi investigado. A imagem em modo contato permite a visualização da atividade enzimática no substrato com alta resolução lateral. As bicamadas lipídicas foram preparadas pela técnica Langmuir-Blodgett e transferidas para uma célula líquida de AFM. Após a injeção da enzima na célula líquida, uma sequência de imagens foi adquirida em intervalos de tempo regulares para permitir a identificação da estrutura do substrato, os locais preferidos de ativação enzimática e as taxas de reação enzimática. © 2006 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.


Seema, Kumari, R., Gupta, G., Saluja, D., Kumar, A., Goel, S., Tyagi, Y.K., Gulati, R., Vinocha, A., Muralidhar, K., Dwarakanth, B.S., Rastogi, R.C., Parmar, V.S., Patkar, S.A., Raj, H.G.
"Characterization of protein transacetylase from human placenta as a signaling molecule calreticulin using polyphenolic peracetates as the acetyl group donors"
Cell Biochemistry and Biophysics, 47 (1), pp. 53-64. (2007)

Resumo

Demonstramos anteriormente que uma enzima única ligada à membrana realiza a mediação da transferência de grupo(s) acetil de peracetatos polifenólicos (PA) para proteínas funcionais, sendo denominado fármaco acetóxi: proteína transacetilase (TAase), pois atuou em várias classes de PA. Aqui, relatamos a purificação da TAase de microssomas placentários humanos para homogeneidade com massa molecular de 60 kDa, apresentando diferentes graus de especificidade para várias classes de PA e confirmando a relação estrutura-atividade para o TAASE ligado a microssomas. A acetilação da proteína catalisada por TAase por um fármaco acetóxi modelo, 7,8-diacetoxi-4-metilcumarina (DAMC) foi estabelecida pela demonstração de imunorreatividade da proteína alvo acetilada com anticorpo antiacetil lisina. A atividade de TAase foi inibida severamente em microssomas agregados de cálcio, bem como quando Ca2+ foi adicionado à TAase purificada, sugerindo que a TAase poderia ser uma proteína de ligação ao cálcio. Além disso, a análise de sequência N-terminal de TAase purificada (EPAVYFKEQFLD) usando o banco de dados Swiss Prot combinou perfeitamente com calreticulina (CRT), uma proteína de ligação ao cálcio microssomal principal do retículo endoplasmático (RE). A identidade da TAase com CRT foi substanciada pela observação de que a TAase purificada reagiu avidamente com o anticorpo comercialmente disponível em comparação com o terminal C da CRT humana (13 peptídeos residuais, DEEDATGQAKDEL). A TAase purificada também mostrou ligação de Ca2+ e atuou como um substrato para a fosforilação catalisada pela proteína quinase C (PKC), que são características marcantes da CRT. Além disso, a CRT placentária purificada, bem como a CRT pura comercialmente produzida, produziram uma atividade catalítica TAase significativa e também foram consideradas eficazes na mediação da acetilação da proteína alvo NADPH citocromo P-450 redutase por DAMC tal como detectado por Western blot utilizando anticorpo antiacetil lisina. Essas observações, pela primeira vez, atribuem convincentemente a função transacetilase à CRT. Portanto, essa função de transacetilase da CRT é designada transacetilase de calreticulina (CRTAase). Consideramos que a CRTAase desempenha um papel importante na modificação de proteínas por meio de acetilação independente de acetilcoenzima A (Acetil-CoA). © Copyright 2007 by Humana Press Inc. Todos os direitos reservados.


Rathore, N., Gellman, S.H., De Pablo, J.J.
"Thermodynamic stability of β-peptide helices and the role of cyclic residues"
Biophysical Journal, 91 (9), pp. 3425-3435. (2006)

Resumo

Os beta-peptídeos estão emergindo como uma classe atrativa de moléculas peptidomiméticas. Em contraste com os peptídeos α de ocorrência natural, os oligômeros curtos de β-aminoácidos (que compreendem apenas 4–6 monômeros) apresentam estruturas secundárias estáveis que os tornam suscetíveis a estudos quantitativos, experimentais e teóricos sobre os efeitos de interações químicas particulares na estrutura. Neste estudo, simulações moleculares são usadas para estudar a estabilidade termodinâmica das conformações helicoidais formadas por peptídeos β contendo proporções variáveis de resíduos acíclicos (β3) e cíclicos (ACH). Mais especificamente, vários peptídeos β que diferem apenas no seu conteúdo de resíduos cíclicos são considerados neste estudo. Estudos computacionais anteriores de β-peptídeos basearam-se principalmente na minimização de energia de simulações de dinâmica molecular. Em contraste, nosso estudo baseia-se em simulações de Monte Carlo baseadas em densidade de estados para calcular a energia livre e examinar a estabilidade de várias estruturas dobradas dessas moléculas usando um parâmetro de ordem bem definido. Ao recorrer a um formalismo de conjunto expandido, podemos determinar a energia livre necessária para desenvolver moléculas específicas, uma quantidade que pode ser medida diretamente através de espectroscopia de força de molécula única. As simulações em solventes implícitos e explícitos permitiram um estudo sistemático do papel dos resíduos cíclicos e da eletrostática na estabilidade das estruturas secundárias. As moléculas consideradas neste estudo demonstram apresentar conformações helicoidais H-14 estáveis e, em alguns casos, conformações H-12 relativamente estáveis, sugerindo assim que a qualidade do solvente pode ser usada para manipular os padrões de ligação ao hidrogênio e a estrutura desses peptídeos. © 2006 by the Biophysical Society.


Ransbarger, D., Xu, F.
"Activation of laccase by penicillin and derivatives"
Process Biochemistry, 41 (9), pp. 2082-2086. (2006)

Resumo

Capaz de oxidizar uma ampla gama de substâncias redutoras, a lacase possui um grande potencial para várias aplicações biocatalíticas. Estão sendo feitos esforços amplos de pesquisa para melhorar a atividade, especificidade e estabilidade da lacase. Observamos que a pré-incubação com penicilina levou a uma ativação significativa de uma lacase Rhizoctonia solani, embora a penicilina não fosse um substrato redox da enzima. A ativação afetou principalmente o Kcat da lacase, e o efeito foi ótimo a um pH de 5. A ampicilina e o ácido peniciloico também foram ativos na lacase (embora seu efeito tenha sido mais fraco que o da penicilina), porém, o ácido 6-aminopenicilânico, o ácido fenilacético e a cefalexina não estavam ativos. O efeito aparente da penicilina foi atribuído a uma interação não redox com a base do polipeptídeo da lacase. O efeito foi significativamente mais fraco nas lacases Mycoeophthora thermophila e Trametes villosa. © 2006 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.


Rodriguez-Larrea, D., Minning, S., Borchert, T.V., Sanchez-Ruiz, J.M.
"Role of Solvation Barriers in Protein Kinetic Stability"
Journal of Molecular Biology, 360 (3), pp. 715-724. (2006)

Resumo

A estabilidade de vários sistemas proteicos de interesse demonstrou ter uma base cinética. Além das óbvias implicações biotecnológicas, o interesse geral de entender a estabilidade cinética proteica é enfatizado pelo fato de que algumas abordagens moleculares emergentes para a inibição da amiloidogênese se concentram no aumento da estabilidade cinética de estados nativos de proteína. As lipases estão entre as enzimas industriais mais importantes. Aqui, estudamos a desnaturação térmica de tipo selvagem, quatro variantes de um único mutante e duas variantes de lipase múltiplas mutantes altamente estáveis de Thermomyces lanuginosa. Em todos os casos, a desnaturação térmica foi irreversível, controlada cineticamente e conformada ao modelo irreversível de dois estados. Este resultado sustenta que a nova abordagem de evolução direta focada na dinâmica molecular envolvida na preparação das variantes altamente estáveis é bem-sucedida porque aborda a estabilidade cinética e, em particular, porque as simulações de dinâmica molecular aquecidas possivelmente identificam regiões de interações nativas interrompidas no estado de transição para a desnaturação irreversível. Além disso, encontramos efeitos de mutação muito grandes na entalpia de ativação e na entropia, que não foram acompanhados por mudanças semelhantes no valor de m da ureia cinética. A partir disso, somos levados a concluir que esses efeitos de mutação estão associados a alguma característica estrutural do estado de transição para o processo de desnaturação irreversível que não está vinculado a grandes mudanças na acessibilidade ao solvente. Estudos computacionais recentes sugeriram a existência de barreiras de solvatação/desolvatação em pelo menos alguns processos de dobramento/desdobramento da proteína. Propomos, portanto, que uma barreira de solvatação (decorrente da assincronia entre quebra de contatos internos e penetração de água) possa contribuir para a estabilidade cinética da lipase de T. lanuginosa (e, possivelmente, para a estabilidade cinética de outras proteínas). © 2006 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.


Sonesson, A.W., Elofsson, U.M., Brismar, H., Callisen, T.H.
"Adsorption and mobility of a lipase at a hydrophobic surface in the presence of surfactants"
Langmuir, 22 (13), pp. 5810-5817. (2006)

Resumo

Com o objetivo de poder manipular os processos envolvidos na catálise interfacial, estudamos os efeitos de uma mistura de surfactantes não iônicos/aniônicos, C12E1/LAS (1:2 mol %), sobre a adsorção e mobilidade superficial de uma lipase obtida de Thermomyces lanuginosus (ILL). A ressonância de plasmon de superfície (SPR, na sua sigla em inglês) e a elipsometria foram utilizadas para analisar o processo de adsorção competitivo entre surfactantes e TLL em superfícies de modelos hidrofóbicos destinadas a imitar um substrato oleoso para a lipase. Obtivemos o coeficiente de difusão superficial de uma variante de TLL marcada de forma fluorescente em silica silanizada com octadeciltriclorosilano (OTS) por recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP) em um microscópio de varredura laser confocal. Por meio da elipsometria, calibramos a intensidade de fluorescência com a densidade da superfície da lipase. A difusão de TLL foi medida em diferentes densidades de superfície da enzima e em dois intervalos de tempo após coadsorção com diferentes concentrações de C12E6/LAS. As concentrações de surfactantes foram escolhidas para representar concentrações abaixo da concentração micelar crítica (CMC), na região CMC e acima da CMC. A difusão aparente da superfície de TLL foi extrapolada para a diluição da superfície infinita, D 0. Descobrimos que a presença de surfactantes modulava fortemente a mobilidade da superfície de TLL: com D0 = 0,8 × 10–11 cm2/s sem surfactantes e D0 = 13,1 × 10–11 cm2/s com surfactantes acima da CMC. O aumento da mobilidade da lipase ao passar pelo CMC também foi acompanhado de um aumento de 2 vezes na fração móvel de TLL. A análise de SPR revelou que a TLL ligada à superfície foi deslocada por C12E6/LAS de uma maneira dependente da concentração, sugerindo que o aumento observado na mobilidade da superfície transmite a difusão mediada em massa e a chamada reconexão do TLL à superfície. Nossos resultados combinados na adsorção competitiva de lipase/surfactante e na mobilidade da superfície da lipase mostram como os surfactantes podem desempenhar um papel importante na regulação da catálise interfacial, desde a digestão fisiológica até aplicações técnicas como a detergência. © 2006 American Chemical Society.


Raj, H.G., Kumari, R., Seema, Gupta, G., Kumar, R., Saluja, D., Muralidhar, K.M., Kumar, A., Dwarkanath, B.S., Rastogi, R.C., Prasad, A.K., Patkar, S.A., Watterson, A.C., Parmar, V.S.
"Novel function of calreticulin: Characterization of calreticulin as a transacetylase-mediating protein acetylator independent of acetyl CoA using polyphenolic acetates"
Pure and Applied Chemistry, 78 (5), pp. 985-992. (2006).

Resumo

Nossas investigações anteriores culminaram com a descoberta de uma enzima única ligada à membrana em células de mamíferos que catalisam a transferência do grupo acetil de acetatos polifenólicos (APs) para certas proteínas funcionais, resultando na modulação de suas atividades. Essa enzima foi denominada fármaco acetóxi: proteína transacetilase (TAase), uma vez que atuou em várias classes de APs. O TAase foi purificado de microssomas de fígado de ratos para homogeneidade e exibiu o peso molecular de 55 KDa. A acetilação da proteína catalisada por TAase por APs foi evidenciada pela demonstração da imunorreatividade da proteína alvo acetilada, como óxido nítrico sintetase (NOS) com anticorpo antiacetil lisina. A possível acetilação de NOS de plaquetas humanas por AP, como descrito acima, resultou no aumento dos níveis intracelulares de óxido nítrico (NO). As APs, ao contrário dos polifenóis parentais, apresentaram efeitos fisiológicos relacionados ao NO. Verificou-se que a sequência N-terminal mostra 100% de homologia com a sequência N-terminal de calreticulina (CRT) madura. A identidade de TAase com CRT, uma proteína de reticulo endoplasmático (RE), foi evidenciada pela demonstração das propriedades de CRT, como imunorreatividade com anticalreticulina, ligação a íons Ca2+ e como substrato para fosforilação por proteína quinase c (PKC) que são as características de marca registrada da CRT. Essas observações, pela primeira vez, atribuem de forma convincente a função transacetilase ao CRT, o que possivelmente desempenha um papel importante na modificação de proteínas por meio da acetilação de várias enzimas através de um mecanismo bioquímico independente de Acetil-CoA. © 2006 IUPAC.


Høiberg-Nielsen, R., Fuglsang, C.C., Arleth, L., Westh, P.
"Interrelationships of glycosylation and aggregation kinetics for Peniophora lycii phytase"
Biochemistry, 45 (15), pp. 5057-5066. (2006)

Resumo

A cinética da agregação induzida termicamente da glicoproteína fitase Peniophora lycii (Phy) e uma forma desglosilada (dgPhy) foi estudada por espalhamento de luz dinâmico (DLS) e estático (SLS). Isso proporcionou uma visão detalhada sobre o curso do tempo da formação de pequenos agregados (~10–100 moléculas) da enzima. A estabilidade termodinâmica das duas formas também foi investigada usando calorimetria de varredura diferencial (DSC, na sua sigla em inglês). Verificou-se que os glicanos promoveram fortemente a estabilidade cinética (isto é, reduziram a taxa de desnaturação irreversível) deixando a temperatura de desnaturação (Td) de equilíbrio, definida por DSC, em grande parte inalterada. A um pH de 4,5–5,0, por exemplo, a dgPhy agregou ~200 vezes mais rápido do que a Phy, embora a diferença em Td tenha sido de apenas 1–3 °C. Para elucidar o mecanismo pelo qual os glicanos promovem a estabilidade cinética, medimos o efeito da força iônica e da temperatura sobre a taxa de agregação. Além disso, o segundo coeficiente virial (B22) para as duas formas foi medido por SLS. Esses resultados mostraram que a taxa de agregação de Phy escalou com a concentração de proteína desnaturada termicamente. Isso sugeriu cinética de primeira ordem em relação à concentração do estado termicamente desnaturado. Uma correlação similar, mas menos pronunciada, foi encontrada para dgPhy e sugeriu-se que, embora o processo de agregação para a forma desglosilada seja dominado por proteína desnaturada, também envolve uma contribuição menor das moléculas associadas no estado nativo. As medições de B22 revelaram que dgPhy apresentou valores ligeiramente superiores aos de Phy. Isso sugere que dgPhy interage mais favoravelmente com o tampão do que Phy e, portanto, descarta a forte hidratação dos glicanos como a origem de seu efeito sobre a estabilidade cinética. Com base nisso e nos efeitos do pH e da força iônica, sugerimos que é mais provável que a inibição da agregação dependa do impedimento estérico dos glicanos na forma agregada da proteína. © 2006 American Chemical Society.


Bagger, H.L., Fuglsang, C.C., Westh, P.
"Hydration of a glycoprotein: Relative water affinity of peptide and glycan moieties"
European Biophysics Journal, 35 (4), pp. 367-371. (2006)

Resumo

A glicosilação, a modificação pós-translacional mais prevalente das proteínas, afeta uma série de propriedades físicas, incluindo as interações com o solvente aquoso envolvente. Essas interações glicano-água foram discutidas em relação à solubilidade aumentada geralmente observada para glicoproteínas, mas o suporte experimental dessa correlação permanece escasso. Aplicamos um método calorimétrico de dois canais para medir a energia livre e a entalpia de hidratação a 25 °C para a glicoproteína fitase (Phy) e uma forma desglosilada (dgPhy) da mesma proteína. As comparações dos resultados para Phy e dgPhy mostram que a fração polipeptídica possui maior afinidade com água do que os glicanos. De fato, em níveis moderados de hidratação (~0,3 g de macromolécula de água/g), a absorção de água parece ser inteiramente regida pela adsorção aos grupos de peptídeos. Concluímos que a interação reforçada com o solvente é improvável de que seja o mecanismo subjacente ao aumento da solubilidade e menor propensão de agregação, muitas vezes relatada como resultado da glicosilação de proteínas. © EBSA 2005.


Hedin, E.M.K., Høyrup, P., Patkar, S.A., Vind, J., Svendsen, A., Hult, K.
"Implications of surface charge and curvature for the binding orientation of Thermomyces lanuginosus lipase on negatively charged or zwitterionic phospholipid vesicles as studied by ESR spectroscopy"
Biochemistry, 44 (50), pp. 16658-16671. (2005)

Resumo

A lipase de triglicerídeos (EC 3.1.1.3) lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) se liga com alta afinidade a vesículas de fosfolipídios unilamelares que servem de interface de diluente tanto para lipase como para substrato, mas exibe a ativação interfacial em apenas pequenas e carregadas negativamente tais vesículas [Cajal, Y. et al. (2000) Bioquímica 39, 413-423]. A orientação de ligação ao modo produtivo de TLL na interface lipídico-água de vesículas unilamelares pequenas (SUV, na sua sigla em inglês) consistindo em 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol (POPG) foi previamente determinada usando respectroscopia de ressonância de spin eletrônico (ESR) em combinação com marcação de spin sítio direcionada [Hedin, EMK, et al. (2002) Bioquímica 41, 14185-14196]. Em nossa investigação, estudamos a orientação interfacial de TLL quando ligada a vesículas unilamelares grandes (LUV), consistindo em POPG, e ligadas a SUV, consistindo em 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (POPC). Onze mutantes de TLL de uma única cisteína foram marcados por spin como descrito anteriormente e estudados após a ligação à membrana usando o agente de relaxamento de spin solúvel em água cromo (III) oxalato (Crox). Além disso, as vesículas marcadas com dansil revelaram a eficiência de eliminação de fluorescência intermolecular entre cada marcador por spin posicionado em TLL e a membrana lipídica. A exposição a ESR e os dados de eliminação de fluorescência mostram que TLL se associa mais perto da superfície de fosfatidilglicerol carregada negativamente do que a superfície de fosfatidilcolina zwitteriônica e liga-se tanto ao POPG LUV quanto ao POP SUV predominantemente através da parte traseira côncava de TLL oposto ao local ativo, conforme revelado pelos resíduos de contato K74C-SL, R209C-SL e T192C-SL. Essa orientação é significativamente diferente comparada à de POPG SUV e pode explicar as diferenças na ativação da lipase. Evidentemente, tanto a carga como a acessibilidade (curvatura) da superfície da vesícula determinam a orientação de TLL na interface dos fosfolipídios. © 2005 American Chemical Society.


Sonesson, A.W., Callisen, T.H., Brismar, H., Elofsson, U.M.
"Lipase surface diffusion studied by fluorescence recovery after photobleaching"
Langmuir, 21 (25), pp. 11949-11956. (2005)

Resumo

Analisamos as propriedades de difusão superficial de uma variante da lipase da Thermomyces lanuginosa (TLL) em sílica hidrófila e sílica metilada com diclorodimetilsilano (DDS) ou octadeciltriclorosilano (OTS). Para este estudo, foi desenvolvido um novo método de análise de difusão em superfícies sólidas. O método baseia-se na recuperação de fluorescência após fotodegradação usando microscopia confocal. Quando uma área retangular da amostra foi fotodegradada, a recuperação de fluorescência poderia ser analisada como difusão unidimensional, resultando em expressões matemáticas simplificadas para ajustar os dados. O método foi inicialmente testado medindo a difusão de albumina de soro bovino no vidro, o que levou a um coeficiente de difusão em boa correspondência com relatórios anteriores. Para a análise da difusão de TLL, os dados de elipsometria da adsorção de TLL foram utilizados para calibrar a intensidade de fluorescência na densidade superficial da lipase, permitindo medições do coeficiente de difusão em diferentes densidades de superfície. O coeficiente médio de difusão foi calculado em dois intervalos de tempo após a adsorção. A fração móvel e o coeficiente de difusão foram mais baixos na superfície OTS, quando extrapolados para a diluição da superfície infinita. Além disso, a taxa de difusão diminuiu com o tempo nas superfícies hidrofóbicas. Nossas observações podem ser explicadas pela dependência superficial da distribuição de orientações e conformações de TLL adsorvida, em que a transição da estrutura fechada para a aberta catalítica ativa e mais hidrofóbica é importante. © 2005 American Chemical Society.


Rønne, T.H., Pedersen, L.S., Xu, E.
"Triglycéride selectivity of immobilized thermomyces lanuginosa lipase in interesterification"
JAOCS, Journal of the American Oil Chemists' Society, 82 (10), pp. 737-743. (2005)

Resumo

A seletividade de triglicerídeos (ácidos graxos) de uma lipase imobilizada de Thermomyces lanuginosa (Lipozyme® TL IM) foi investigada em reações de interesterificação catalisadas por lipase entre dois TG monoácidos em n-hexano. Tristearina (tri-C18:0) foi usada como uma referência em uma série de triglicerídeos com FA saturada de tri-C4:0 a tri-C20:0, exceto por tri-C6:0, e em uma série de FA não saturada de tri-C18:1 a tri-C18:3. A quantificação foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, e foram utilizados diferentes métodos de avaliação de seletividade. Nenhum dos métodos utilizados mostrou diferenças significativas entre os desempenhos da lipase em triglicerídeos diferentes, indicando que o Lipozyme TL IM não é seletivo em relação a ácidos graxos ou triglicerídeos no sistema utilizado. Um projeto de superfície de resposta foi utilizado para investigar a influência das atividades de água (aw) e as temperaturas de reação na reatividade do Lipozyme TL IM com um sistema de tripalmitina (tri-C16:0) e trilaurina (tri-C12:0) em n-hexano. Observou-se que um aumento da temperatura (40 a 60 °C) afeta significativamente a reatividade da lipase. A reatividade do Lipozyme TL IM não foi afetada pela alteração em aw de 0,1130 para 0,5289. Um aumento em aw só levou a um aumento na formação de ácidos graxos livres. Copyright © 2005 by AOCS Press.


Nielsen, A.D., Arleth, L., Westh, P.
"Analysis of protein-surfactant interactions - A titration calorimetric and fluorescence spectroscopic investigation of interactions between Humicola insolens cutinase and an anionic surfactant"
Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1752 (2), pp. 124-132. (2005)

Resumo

Estudamos as interações de cutinase (HiC) a partir de Humicula insolens e sulfato de dodecil de sódio (SDS) por meio de investigações paralelas de calorimetria e fluorescência de sistemas em que a concentração de ambos os componentes foi modificada sistematicamente. Os resultados dos dois métodos exibem uma série de características síncronas, quando um gráfico é gerado em comparação à concentração SDS total, [SDS]tot. A origem molecular de várias dessas anomalias foi atribuída, e cinco intervalos de [SDS]tot, em que modos diferentes de interação dominaram, foram identificados. Passando de [SDS]tot baixo para alto, estes modos foram: ligação de (alguns) SDS a HiC nativo, formação de agregados de proteína oligomérica, desnaturação de HiC e adsorção de SDS em proteínas desnaturadas. Para [SDS]tot > 3–6 mM (dependendo da concentração de proteína), a adsorção saturada e nenhuma outra interação proteína-detergente pôde ser detectada. Duas anomalias particularmente notáveis nos dados calorimétricos foram atribuídas respectivamente a desnaturação e saturação. Verificou-se que [SDS]tot nesses pontos dependia linearmente da concentração de proteína (total), [HiC]. Sugerimos que isso reflita o equilíbrio entre SDS livre e SDS [SDS]tot = [SDS] aq + [HiC] Nb, onde [SDS] aq e Nb são, respectivamente, a concentração aquosa ("livre") de SDS e número médio de SDS ligado por proteína. A interpretação dos resultados ao longo dessas linhas mostrou que a 22°C e pH de 7,0, a HiC desnatura. Rosgaard, L., Zygadlo, A., Scheller, H.V., Mant, A., Jensen, P.E.


"Insertion of the plant photosystem I subunit G into the thylakoid membrane: In vitro and in vivo studies of wild-type and tagged versions of the protein"
FEBS Journal, 272 (15), pp. 4002-4010. (2005)

Resumo

A subunidade G do fotossistema I é uma proteína codificada por genoma nuclear, prevista para formar duas hélices α de transmembrana separadas por uma região de loop. Usamos ensaios de importação in vitro para mostrar que o domínio de loop carregado positivamente está voltado para o estroma, enquanto os terminais N e C provavelmente estão voltados para o lúmen. Construtos de PSI-G em que uma etiqueta His ou Strep é colocada no terminal C ou na inserção da região do loop com a mesma topologia que a subunidade G de fotossistema I do tipo selvagem (PSI-G). No entanto, a presença das etiquetas no loop torna a proteína inserida na membrana significativamente mais sensível à tripsina, aparentemente interrompendo a interação entre o loop e o núcleo do PSI. Plantas knockout (nocaute ou inativa) que não possuíam PSI-G foram transformadas com construtos que codificam as proteínas PSI-G marcadas com loop e do C-terminal. As experiências em tilacoides das linhas transgênicas mostram que as versões de PSI-G marcadas terminalmente em C adotam a mesma topologia que o tipo selvagem de PSI-G, e as versões marcadas com loop afetam a sensibilidade da região de loop para tripsina, confirmando assim as observações in vitro. Além disso, a purificação de complexos de PSI a partir de plantas transgênicas revelou que todas as versões marcadas de PSI-G são incorporadas e retidas no complexo PSI, embora as variantes marcadas com C-terminal de PSI-G tenham sido preferencialmente retidas. Isso sugere que a região de loop do PSI-G é importante para uma integração adequada no núcleo do PSI. Nossos experimentos demonstram que é possível produzir PSI marcado com His e Strep em plantas e fornecem evidências adicionais de que a topologia das proteínas da membrana é ditada pela distribuição de cargas positivas, que resistem à translocação através das membranas. © 2005 FEBS.


Nielsen, A.D., Arleth, L., Westh, P.
"Interactions of Humicola insolens cutinase with an anionic surfactant studied by small-angle neutron scattering and isothermal titration calorimetry"
Langmuir, 21 (10), pp. 4299-4307. (2005)

Resumo

A interação de cutinase com Humicula insolens (HiC) e dodecilsulfato de sódio (SDS) foi investigada por espalhamento de neutrons de pequeno ângulo (SANS, na sua sigla em inglês) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A interpretação concertada das informações estruturais e termodinâmicas para sistemas idênticos mostrou-se valiosa na tentativa de elucidar os complexos modos de interação proteína-detergente. Particularmente, na temperatura experimental de 22 °C, em que a formação de micelas de SDS é atérmica (ΔH = 0), e os efeitos das interações proteína-detergente se destacam claramente nos termogramas. Verificou-se que o efeito de SDS sobre a cutinase dependia fortemente da composição da amostra. Assim, a adição de SDS correspondente a uma razão molar, nS = nSDS/n HiC de cerca de 10, foi associada à formação de agregados HiC/SDS, que incluem mais de uma molécula de proteína. Os resultados do SANS sugeriram que, na média, esses adutos continham duas HiC, e os traçados de ITC mostraram que eles se formam e quebram devagar. Com concentrações de SDS ligeiramente mais altas (ns = 10-25) estes "dímeros" se dissociaram e a proteína desnaturou. A desnaturação mostrou a mudança de entalpia positiva característica, mas o estado desnaturado de SDS da HiC foi excepcionalmente compacto com um raio de giração próximo da conformação nativa. A titulação adicional com SDS esteve associada à ligação exotérmica à proteína desnaturada até o ponto de saturação em cerca de ns = 90. Neste ponto, a concentração de monômero livre foi de 2,2 mM, e o número de ligação foi de ~40 SDS/HiC. Interessantemente, este grau de ligação SDS (~0,5 g de SDS/g de HiC) é inferior a metade da quantidade ligada a proteínas típicas solúveis em água. © 2005 American Chemical Society.


Eriksson, J., Malmsten, M., Tiberg, F., Callisen, T.H., Damhus, T., Johansen, K.S.
"Model cellulose films exposed to H. insolens glucoside hydrolase family 45 endo-cellulase - The effect of the carbohydrate-binding module"
Journal of Colloid and Interface Science, 285 (1), pp. 94-99. (2005)

Resumo

Os efeitos da estrutura enzimática e da atividade sobre a degradação de substratos de celulose modelo foram investigados por elipsometria para a celulase Humicola insolens GH45. Verificou-se que a variante inativa D10N se adsorveu na superfície de celulose, mas também para se incorporar às películas de celulose a um nível que dependia do pH. Para a proteína nativa, a adsorção inicial monitorada para a variante inativa D10N foi seguida por degradação mediada por enzimas das películas de celulose. Novamente, uma dependência do pH foi encontrada, de modo que o pH mais alto resultou em uma degradação enzimática mais lenta. A remoção do módulo de ligação a carboidratos eliminou essa dependência do pH, mas também resultou em uma diminuição da adsorção para a superfície da celulose e em um efeito catalítico líquido diminuído. © 2004 Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.


Ternström, T., Svendsen, A., Akke, M., Adlercreutz, P.
"Unfolding and inactivation of cutinases by AOT and guanidine hydrochloride"
Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1748 (1), pp. 74-83. (2005)

Resumo

Apresentamos uma análise comparativa do desdobramento e da inativação de três cutinases na presença de hidrocloridrato de guanidina (GdnHCl) e bis (2-etil hexil) sulfossuccinato de sódio (AOT). Pesquisas anteriores se concentraram na cutinase de Fusarium solani pisi (FsC). Além do FsC, o presente estudo inclui a cutinase de Humicola insolens (HiC) e uma variante mutante de HiC (μHiC) com maior atividade e menor sensibilidade ao surfactante. O equilíbrio e a desnaturação resolvida por tempo pelo AOT foram estudados em solução aquosa e micelas reversas e foram comparados à desnaturação de GdnHCl. Os perfis de desnaturação de CD e fluorescência far-UV obtidos nas soluções aquosas dos dois desnaturantes coincidem para as três cutinases, indicando que o desdobramento é um processo cooperativo de dois estados nestas condições. Em micelas reversas, as cutinases se desdobram com taxas mono-exponenciais, indicando novamente um processo de dois estados. A energia livre de desnaturação na água foi calculada por extrapolação linear de dados de equilíbrio, produzindo valores muito semelhantes para as três cinases com médias de -11,6 kcal mol -1 e -2,6 kcal mol-1 para GdnHCl e AOT, respectivamente. Portanto, o estado desnaturado de AOT (DAOT) é menos desestabilizado do que o estado desnaturado de GdnHCl (DGdnHCl), em relação ao estado nativo em água. A espectroscopia de CD Far-UV revelou que o DAOT mantém alguma estrutura secundária, enquanto o DGdnHCl é essencialmente não estruturado. Da mesma forma, os dados de fluorescência sugerem que o DAOT é mais compacto do que o DGdnHCl. As medidas de atividade revelam que tanto DAOT como DGdnHCl são praticamente inativos (atividade catalítica <1% daquela da enzima nativa). O espectro de fluorescência de DAOT em micelas reversas não diferiu significativamente do observado em AOT aquoso. Estudos sobre RMN de DAOT em micelas reversas indicaram que a estrutura é característica de um glóbulo fundido, consistente com CD e dados de fluorescência. © 2004 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.


Von Ossowski, I., Eaton, J.T., Czjzek, M., Perkins, S.J., Frandsen, T.P., Schülein, M., Panine, P., Henrissat, B., Receveur-Bréchot, V.
"Protein disorder: Conformational distribution of the flexible linker in a chimeric double cellulase"
Biophysical Journal, 88 (4), pp. 2823-2832. (2005)

Resumo

As propriedades estruturais do peptídeo ligante que liga o módulo de ligação à celulose ao módulo catalítico nas celulases bimodulares foram investigadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Como o vinculador e o módulo de ligação à celulose são relativamente pequenos e não podem ser facilmente detectados separadamente, a conformação do ligante foi estudada por meio de uma proteína de fusão artificial, Cel6BA, na qual um ligador de 88 resíduos conecta os grandes módulos catalíticos das celulases Cel6A e Cel6B da Humicola insolens. Nossos dados mostraram que a Cel6BA é muito alongada, com uma dimensão máxima de 178 A, mas não pode ser descrita por uma única conformação. A modelagem de uma série de conformadores de Cel6BA com separações de interdomínio variando entre 10 Å e 130 Å mostrou que os bons ajustes do perfil Guinier e P(r) foram obtidos por uma média ponderada das curvas de espalhamento de todos os modelos, em que o vinculador segue uma distribuição não aleatória, com preferência pelos conformadores mais compactos. Essas propriedades estruturais provavelmente serão essenciais para a função do vinculador como uma mola molecular entre os dois módulos funcionais. O espalhamento de raios-X a baixo ângulo, portanto, fornece uma ferramenta única para analisar quantitativamente o transtorno conformacional típico das proteínas descritas como nativamente desdobradas. © 2005 by the Biophysical Society.


Maurus, R., Begum, A., Kuo, H.-H., Racaza, A., Numao, S., Andersen, C., Tams, J.W., Vind, J., Overall, C.M., Withers, S.G., Brayer, G.D.
"Structural and mechanistic studies of chloride induced activation of human pancreatic α-amylase"
Protein Science, 14 (3), pp. 743-755. (2005)

Resumo

O mecanismo de ativação alostérica de α-amilase por cloreto foi estudado através de experimentos estruturais e cinéticos com foco na variante N298S dependente de cloreto de α-amilase pancreática humana (HPA) e uma TAKA-amilase independente de cloreto. A análise cinética da variante HPA demonstra claramente o efeito ativador pronunciado da ligação do íon de cloro nas taxas de reação e seu efeito sobre a dependência do pH da catálise. As alterações estruturais observadas na variante N298S após ligação de íons de cloreto sugerem que o íon de cloreto desempenha uma variedade de papéis que servem para promover a catálise. Um deles tem uma forte influência no posicionamento do resíduo catalítico ácido/base E233. A ausência de íons de cloreto resulta em conformações múltiplas para este resíduo e produtos enzimáticos inesperados. O íon de cloreto e o N298 também parecem estabilizar uma região helicoidal da cadeia de polipeptídeo, a qual projeta o loop de ligação de substrato flexível exclusivo para α-amilases dependentes de cloreto. Essa característica estrutural também serve para orientar adequadamente o resíduo catalítico essencial D300. As análises comparativas mostram que as α-amilases independentes de cloreto compensam a ausência de cloreto ligado ao substituir um núcleo hidrofóbico, alterando a maneira pela qual as interações do substrato são feitas e deslocando o posicionamento de N298. Essas diferenças evolutivas provavelmente podem surgir em resposta a ambientes operacionais alternativos ou à vantagem obtida em um determinado perfil de produto. As tentativas de engenharia de dependência de cloreto na TAKA-amilase independente de cloreto apontam a complexidade desse sistema e o fato de que uma grande quantidade de fatores desempenham um papel na ligação do íon de cloreto com as α-amilases dependentes de cloreto.


Høyrup, P., Callisen, T.H., Jensen, M.Ø., Halperin, A., Mouritsen, O.G.
"Lipid protrusions, membrane softness, and enzymatic activity"
Physical Chemistry Chemical Physics, 6 (7), pp. 1608-1615. (2004)

Resumo

A atividade da fosfolipase A2 em bicamadas lipídicas exibe um comportamento característico de lag-burst (retardo e aceleração) que já demonstrou refletir as propriedades físicas do substrato. Ainda não ficou claro qual mecanismo molecular subjacente é responsável por esse fenômeno. Propomos aqui que as protrusões de moléculas lipídicas únicas do plano bicamada poderiam fornecer esse mecanismo. A proposta é apoiada por uma combinação de simulações, teoria e experiências de dinâmica molecular de escala atômica, que foram realizadas para investigar a relação entre modos de protrusão de lipídios, por um lado, e a suavidade mecânica de bicamadas de fosfolipídeos e, por outro lado, a atividade de enzimas que atuam sobre bicamadas lipídicas compostas por diferentes lipídeos não saturados. Especificamente, nossos experimentos mostram uma correlação entre a rigidez de dobra da bicamada e a aparente energia de ativação de Arrhenius extraída de análises sistemáticas de tempo decorrido versus temperatura.


H.L. Bagger; C.C. Fuglsang; P. Westh. (2003)
"Preferential binding of two compatible solutes to the glycan moieties of Peniophora Lycii phytase."
Biochemistry, 42, 10295-10300 (2003)

Resumo

O regulamento do comportamento de hidratação e os efeitos concomitantes sobre a solubilidade e outras propriedades foram sugeridos como função principal da glicosilação proteica. Neste trabalho, estudamos a hidratação da fitase de Peniophora lycii fortemente glicosilada em soluções (0,15–1,1 m) dos dois solutos de glicerol e sorbitol compatíveis. As medidas osmométricas mostraram que o glicerol se liga preferencialmente à fitase (ou seja, as interações de glicerol-glicoproteína são mais favoráveis do que as interações água-glicoproteína, resultando em uma acumulação preferencial de glicerol perto da interface proteica), enquanto o sorbitol é preferencialmente excluído da esfera de hidratação (as interações água-glicoproteína são as mais favoráveis). Para avaliar as contribuições das porções de carboidratos e peptídeos, respectivamente, comparamos a fitase (Phy) e uma forma modificada, ainda que enzimaticamente ativa (dgPhy), em que 90% dos glicanos foram removidos. Isso revelou que ambos os polióis apresentaram um grau pronunciado e aproximadamente igual de ligação preferencial à porção de carboidrato. Essa ligação preferencial de polióis a glicanos contrasta com a exclusão das interfaces peptídicas aqui observadas (para dgPhy) e em inúmeros relatórios anteriores sobre proteínas não glicosiladas. Apesar das diferenças distintas entre os grupos de peptídeos e carboidratos, a glicosilação não teve efeito sobre a ação de estabilização proporcionada pelo glicerol e pelo sorbitol. Com base nisso, concluiu-se que a capa de carboidratos de Phy é igualmente acessível nos estados originais e desnatados termicamente, respectivamente (provavelmente totalmente acessível em ambos) e, portanto, que suas interações com solutos compatíveis têm pouco ou nenhum efeito sobre o equilíbrio conformacional da glicoproteína. Para os equilíbrios de solubilidade e agregação, por outro lado, os resultados sugerem uma estabilização das formas monoméricas induzidas por poliol.


A.D. Nielsen; C.C. Fuglsang; P. Westh.
"Effect of calcium ions on the irreversible denaturation of a recombinant Bacillus halmapalus alpha-amylase: a calorimetric investigation."
Biochem. J., 373, 337-343 (2003)

Resumo

O efeito da temperatura e dos íons de cálcio na desnaturação de uma amilase recombinante da alfa-amilase de Bacillus halmapalus (BHA) foi estudado usando calorimetria. Verificou-se que a inativação térmica da BHA é irreversível e que os íons de cálcio têm um efeito significativo na estabilidade. Assim, observou-se uma temperatura de desnaturação aparente (Td) de 83 °C na presença de excesso de íons de cálcio, enquanto Td diminuiu para 48 °C quando o cálcio foi removido. A diferença na estabilidade térmica com e sem íons de cálcio foi utilizada para desenvolver um procedimento de calorimetria de titulação isotérmica (ITC, na sua sigla em inglês) que permite a determinação simultânea de parâmetros cinéticos e mudanças de entalpia da desnaturação da BHA empobrecida de cálcio. Uma energia de ativação EA de 101 kJ/mol foi encontrada para a desnaturação de BHA empobrecida de cálcio. Os resultados suportam um mecanismo de desnaturação cinética em que a amilase empobrecida de cálcio desnaturava irreversivelmente a baixa temperatura e, se os íons de cálcio estiverem em excesso, a amilase se desnaturaliza irreversivelmente a altas temperaturas. As duas reações de desnaturação são combinadas com o equilíbrio de ligação ao cálcio entre a amilase ligada ao cálcio e empobrecida de cálcio. Uma combinação dos resultados da desnaturação cinética e das constantes de ligação ao cálcio, determinada por calorimetria de titulação isotérmica, foi utilizada para estimar a estabilidade cinética, expressa em termos de meia-vida de BHA em uma função da temperatura e da concentração livre de cálcio-íon. Assim, estima-se que a EA aparente pode ser aumentada para aprox. 123 kJ/mol, aumentando a concentração de cálcio livre.


A.D. Nielsen; M.L. Pusey; C.C. Fuglsang; P. Westh.
"A proposed mechanism for the thermal denaturation of a recombinant Bacillus halmapalus alpha-amylase? the effect of calcium ions."
Biochim. Biophys. Acta., 1652, 52-63 (2003)

Resumo

A estabilidade térmica de uma a-amilase recombinante da alfa-amilase de Bacillus halmapalus (BHA) foi investigada usando espectroscopia de dicroísmo circular (CD, na sua sigla em inglês) e calorimetria de varredura diferencial (DSC, na sua sigla em inglês). Essa alfa-amilase é homóloga a outras alfa-amilases de Bacillus, em que os estudos cristalográficos identificaram a existência de três locais de ligação ao cálcio na estrutura. A desnaturação de BHA é irreversível com um T-m de cerca de 89 ºC, e os termogramas de DSC podem ser descritos usando um modelo irreversível de uma etapa. Observou-se um aumento de 5 ºC em T-m na presença de 10 vezes o excesso de CaCl2. No entanto, também foi observado um aumento concomitante da tendência de agregação. A presença de quelante de cálcio em excesso de 30–40 vezes (ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) ou ácido etilenoglicol-bis [beta-aminoetil éter]-N,N'-tetraacético (EGTA) resulta em uma grande desestabilização de BHA, correspondendo a cerca de 40 ºC de T-m baixo como determinado por CD e DSC. O EGTA em excesso de dez vezes revela termogramas DSC complexos que correspondem a transições reversíveis e irreversíveis, que provavelmente se originam de diferentes populações de complexos BHA/cálcio. A interpretação combinada dessas observações e informações estruturais sobre as alfa-amilases homólogas constitui a base para um mecanismo sugerido subjacente ao mecanismo de inativação da BHA. O mecanismo inclui a desnaturação térmica irreversível de diferentes complexos BHA/cálcio e os equilíbrios de ligação ao cálcio. Além disso, o modelo explica uma mudança estrutural reversível induzida pela temperatura associada à ligação ao cálcio.


F. Xu; E.J. Golightly; K.R. Duke; S.F. Lassen; B. Knusen; S. Christensen; K.M. Brown; S.H. Brown; M. Schulein.
"Humicola insolens cellobiose dehydrogenase: cloning, redox chemistry, and "logic gate"-like dual functionality."
Enzyme and Microbial Technology, 28(9-10), 744-753 (2001)

Resumo

A celobiose desidrogenase é uma hemoflavaenzima que catalisa a transferência sequencial de elétrons de um substrato doador de elétrons (por exemplo, celobiose) para um centro de flavina e, em seguida, para um substrato aceitador de elétrons (por exemplo, quinona) diretamente ou através de um centro de hema após uma transferência de elétron interno da flavina para o heme. Clonamos a desidrogenase de Humicola insolens, que codifica uma proteína de 761 resíduos de aminoácidos contendo um domínio de heme N-terminal e um domínio C-terminal Ravin, e estudou como as transferências de elétrons catalisados são reguladas. Com base na correlação entre a taxa e o potencial redox, demonstramos que, com um centro de flavina reduzido, a enzima, como uma redutase, poderia exportar o elétron do seu centro de heme por meio de um mecanismo de "esfera externa". No entanto, com o centro de flavina "descansando", a enzima poderia ter uma função semelhante à peroxidase e importar o elétron para o centro de heme após uma ativação peroxidativa. A funcionalidade dupla de seu centro de heme torna a enzima um "portal lógico" molecular, no qual o elétron, conforme através do centro do heme, pode ser trocado em termos de direção pelo estado redox do centro de flavina combinado.


C.C. Fuglsang; R.M. Berka; J.A. Wahleithner; S. Kauppinen; J.R. Shuster; G. Rasmussen; T. Halkier,; H. Dalbøge B. Henrissat.
"Biochemical analysis of recombinant fungal mutanases."
J. Biol. Chem. 275, 2009-2018 (2000)

Resumo

A análise da sequência de nucleotídeos mostra que as 1,3-glucanases (mutanases) Trichoderma harzianum e Penicillium purpurogenum possuem estruturas primárias homólogas (53% de identidade de sequência de aminoácidos) e são compostas por dois domínios distintos: um domínio catalítico do NH2-terminal e um domínio de ligação de polissacarídeo COOH-terminal putativo separado por um peptídeo ligador rico em Pro-Ser-Thr O-glicosilado. Cada mutanase foi expressa no hospedeiro de Aspergillus oryzae sob o controle transcricional de um promotor sólido de gene de -amilase. As mutanases recombinantes purificadas mostram um pH ideal na variação de pH 3,5 a 4,5 e uma temperatura ideal em torno de 50–55 °C a pH 5,5. Além disso, apresentam forte ligação ao mutano insolúvel com KD em torno de 0,11 e 0,13 °M a pH 7 para as mutanases P. purpurogenum e T. harzianum, respectivamente. A hidrólise parcial mostrou que o domínio COOH-terminal da mutanase T. harzianum se liga ao mutano. Os domínios catalíticos e os domínios de ligação foram atribuídos a uma nova família de hidrolases de glicosídeos e a uma nova família de domínios de ligação a carboidratos, respectivamente.