Damien Farrell, Helen Webb, Michael A. Johnston, Thomas A. Poulsen, Fergal O’Meara, Lars L. H. Christensen, Lars Beier, Torben V. Borchert, and Jens Erik Nielsen
Biochemistry, 2012, 51 (26), pp 5339–5347
DOI: 10.1021/bi201926f
Publication Date (Web): June 6, 2012
Copyright © 2012 American Chemical Society

Resumo

Sobre a determinação rápida dos mapas de estabilidade proteica: análise experimental e teórica de mutantes de uma serina protease de Nascardiopsis prasina
A estabilidade das serina proteases é de grande importância para sua aplicação em processos industriais. Aqui, estudamos os determinantes da estabilidade de uma serina protease de Nocardiopsis prasina usando ensaios rápidos de atividade residual, um algoritmo de classificação de características e algoritmos de cálculo de energia baseados em estrutura para 121 clones de enzimas mutantes micropurificadas contendo múltiplas mutações pontuais. Usando uma análise de regressão multivariada, analisamos os dados dos clones mutantes e descobrimos que as mutações dos resíduos Asn47 e Pro124 são prejudiciais à estabilidade da enzima. Ambos os resíduos estão situados em loops conhecidos como importantes para a estabilidade da protease α-lítica altamente homóloga. Os cálculos de energia baseados em estrutura com PEATSA proporcionam um bom acordo geral com a tendência de valores medidos experimentalmente, mas também identificam uma série de clones que o algoritmo não consegue prever corretamente. Discutimos o significado dos resultados em relação à estrutura e função de proteases estreitamente relacionadas, comentamos o design experimental ideal ao realizar experimentos de alto rendimento para caracterizar os determinantes da estabilidade proteica e discutimos o desempenho dos cálculos de energia baseados em estrutura com conjuntos de dados complexos como o apresentado aqui.

 

Jones, A., Lamsa, M., Frandsen, T.P., Spendler, T., Harris, P., Sloma, A., Xu, F., Nielsen, J.B., Cherry, J.R.
"Directed evolution of a maltogenic α-amylase from Bacillus sp. TS-25"
Journal of Biotechnology, 134 (3-4), pp. 325-333. (2008)

Resumo

A evolução direcionada, juntamente com uma tela robótica de alto rendimento, foi empregada para ampliar o uso industrial da α-amilase maltogênica Novamyl do Bacillus sp. TS-25. A Novamyl do tipo selvagem é atualmente usada na indústria de panificação como um agente antirressecamento em pães assados em pH neutro ou próximo do neutro. No entanto, a enzima é rapidamente inativada durante o processo de cozimento de pão feito com receitas em pH baixo, e a Novamyl tem, portanto, um efeito benéfico muito limitado para essa aplicação específica. Em um esforço para melhorar o desempenho da Novamyl para aplicações em pães de pH baixo, como sourdough e centeio, duas bibliotecas de PCR propensas a erros foram geradas, expressas em Bacillus subtilis e testadas para variantes com estabilidade térmica e atividade melhoradas em condições de pH baixo. As variantes apresentando desempenho melhorado foram recombinadas iterativamente usando DNA shuffling para criar duas gerações de bibliotecas. Em relação à Novamyl do tipo selvagem, muitas das variantes resultantes exibiram um aumento maior que 10 °C na estabilidade térmica em pH 4,5, uma das quais demonstrou propriedades antirressecamento substanciais em pães de pH baixo. © 2008 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Blanchard, S., Armand, S., Couthino, P., Patkar, S., Vind, J., Samain, E., Driguez, H., Cottaz, S.
"Unexpected regioselectivity of Humicola insolens Cel7B glycosynthase mutants"
Carbohydrate Research, 342 (5), pp. 710-716. (2007)

Resumo

Foram avaliados quatro mutantes de glicosídeo hidrolase de Humicola insolens Cel7B para o acoplamento de fluoreto de lactosil em O-alil-NI-acetil-2II-azido-p-chitobiosídeo. Os mutantes duplos Cel7B E197A H209A e Cel7B E197A H209G catalisam preferencialmente a formação de uma ligação β (1→4) entre os dois dissacarídeos, enquanto que o mutante único Cel7B E197A e o mutante triplo Cel7B E197A H209A A211T produzem predominantemente o tetrassacarídeo com ligação β (1→3). Esse resultado constitui o primeiro relatório da modulação da regiosseletividade através de mutagênese direcionada ao local para uma endoglicossintase. © 2007 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

 

Blanchard, S., Cottaz, S., Coutinho, P.M., Patkar, S., Vind, J., Boer, H., Koivula, A., Driguez, H., Armand, S.
"Mutation of fungal endoglucanases into glycosynthases and characterization of their acceptor substrate specificity"Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 44 (3-4), pp. 106-116. (2007)

Resumo

O mutante de Humicola insolens Cel7B E197A é uma poderosa endoglicossintase que exibe uma especificidade de substrato receptor restrita a β-d-glicosil, β-d-xilosil, β-d-manosil e β-d-glicosaminil em +1 subsítio. Nosso objetivo foi ampliar essa especificidade de substrato para β-d-N-acetilglicosaminil, de modo a obter acesso a uma série mais ampla de estruturas oligossacarídicas obtidas através da síntese assistida de glicossintase. Em uma primeira aproximação, um trissacarídeo com um resíduo de β-d-N-acetilglicosaminil foi ancorado em +1 subsítio de H. insolens Cel7B, indicando que a mutação de um único resíduo, His209, poderia levar à especificação de receptor mais ampla esperada. Foram produzidos três mutantes de glicossintase de H. insolens Cel7B (H209A, H209G e H209A/A211T) e expressos em Aspergillus oryzae. Em paralelo, as investigações de alinhamento de sequências mostraram que várias celulases da família GH7 exibem um resíduo de alanina em vez de histidina na posição 209. Entre eles, descobriu-se que Trichoderma reesei Cel7B, uma endoglicanase que compartilha o maior grau de identidade de sequência com Humicola Cel7B, aceita naturalmente um resíduo de β-d-N-acetilglicosaminil em +1 subsítio. O nucleófilo mutante E196A de T. reesei Cel7B foi produzido e expresso em Saccharomyces cerevisiae, e sua atividade como glicossintase, juntamente com os mutantes de glicossintase de H. insolens, foi avaliada em relação a vários receptores glicosídicos. © 2006 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Eijsink, V.G.H., GÅseidnes, S., Borchert, T.V., Van Den Burg, B.
"Directed evolution of enzyme stability"
Biomolecular Engineering, 22 (1-3), pp. 21-30. (2005)

Resumo

O desenvolvimento de enzimas modernas depende cada vez mais de estratégias baseadas na geração de diversidade e da seleção de variantes com propriedades otimizadas. Em princípio, essas estratégias de evolução direcionadas podem ser usadas para otimizar qualquer propriedade enzimática, que pode ser rastreada de maneira economicamente viável, mesmo que não seja conhecida a base molecular dessa propriedade. A estabilidade é uma propriedade interessante das enzimas porque (1) é de grande importância industrial, (2) é relativamente fácil de pesquisar e (3) a base molecular da estabilidade relaciona-se estreitamente com questões contemporâneas na ciência proteica, como o problema de dobra proteica e doenças de dobra proteica. Logo, a engenharia da estabilidade enzimática é de interesse comercial e científico. Aqui, analisamos como a evolução direta contribuiu para o desenvolvimento de enzimas estáveis e para uma nova visão dos princípios da estabilidade proteica. Vários exemplos recentes são descritos. Esses exemplos demonstram que a evolução direcionada é uma estratégia efetiva para obter enzimas estáveis, especialmente quando usada em combinação com estratégias de engenharia racional ou semirracional. Em relação aos princípios da estabilidade proteica, algumas lições importantes a serem aprendidas com os esforços recentes na evolução direcionada são (1) há muitas formas estruturais para estabilizar uma proteína, que nem sempre é fácil de racionalizar, (2) as proteínas podem muito bem ser estabilizadas através da otimização de suas superfícies, e (3) essa alta estabilidade térmica pode ser obtida sem perda de desempenho catalítico a baixas temperaturas. © 2005 Elsevier B. V. Todos os direitos reservados.

 

Tindbaek, N., Svendsen, A., Oestergaard, P.R., Draborg, H.
"Engineering a substrate-specific cold-adapted subtilisin"
Protein Engineering, Design and Selection, 17 (2), pp. 149-156. (2004)

Resumo

Uma região prevista para ser altamente flexível para uma enzima psicrofílica, subtilisina TA39 (S39), foi transferida em silício para a subtilisina mesofílica, savinase (EC 3.4.21.62), de Bacillus lentus (clausii). O híbrido e a savinase projetados foram inicialmente investigados por simulações dinâmicas moleculares em 300 K para mostrar região vinculativa e flexibilidade global. A região S39 prevista é composta por 12 resíduos que, devido à homologia entre as subtilisinas, resulta em uma alteração total de oito resíduos. Por modificações direcionadas para o sítio, a região foi transferida para a região de ligação de savinase, então foi construído um híbrido de savinase-S39, chamado H5. O híbrido projetado exibiu a mesma temperatura ideal e perfil de pH que a savinase, mas H5 apresentou maior atividade específica no substrato sintético N-sucinil-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Fe-p-nitroanilida (AAPF) em todas as temperaturas medidas e, ao mesmo tempo, H5 demonstrou uma diminuição na termoestabilidade. O híbrido H5 demonstrou especificidade de substrato mais ampla, medida à temperatura ambiente, devido ao aumento da eficiência catalítica em AAPF, AAPA e FAAF em comparação com a savinase (N-sucinil-XXXX-pNA, XXXX = AAPF, AAPA e FAAF). O híbrido H5 exibiu aumento da atividade a baixa temperatura, aumento da região de ligação e flexibilidade global, conforme investigado por simulações moleculares dinâmicas e desestabilização global a partir de medições de calorimetria de varredura diferencial. Essas características psicrofílicas indicaram um aumento na flexibilidade do sítio de ligação, provavelmente devido às modificações P129S, S130G, P131E, e, portanto, mostramos que é possível aumentar a atividade a baixa temperatura e a flexibilidade global através da flexibilidade projetada na região de ligação.

 

M. Schulein.
"Protein engineering of cellulases"
Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1543(2), 239-252 (2000)

Resumo

As celulases são enzimas que hidrolizam as ligações beta-1, 4-glicosídicas da celulose. Eles caem em 13 das 82 famílias de glicosídeos hidrolases identificadas por análise sequencial, mas tradicionalmente são divididas em duas classes denominadas "endoglicanases" (EC 3.2.1.4) e "celobio-hidrolases" (3.2.1.91). Ambos os tipos de celulases degradam celodextrinas solúveis e celulose amorfa, porém, com poucas exceções notáveis, apenas as celobio-hidrolases degradam eficientemente celulose cristalina. A mutagênese direcionada ao sítio tem sido fundamental para a caracterização das celulases, que vão desde a identificação e caracterização de resíduos de ligação e catalíticos putativos, a captura de complexos enzima-substrato por cristalografia até a construção de biocatalisantes novos e melhorados, incluindo "glicossintases". Embora os estudos sobre substratos solúveis e análogos de substrato forneçam uma riqueza de informações, a compreensão do mecanismo de degradação do substrato natural, a celulose cristalina continua a ser um grande desafio.

 

F. Xu; A.E. Palmer; D.S. Yaver; R.M. Berka; G.A. Gambetta; S.H. Brown; E.I. Solomon.
"Targeted mutations in a Trametes villosa laccase: Axial perturbations of the T1 copper."
J. Biol. Chem., 274, 12372-12375 (1999)

Resumo

A lacase de Trametes villosa foi mutada em um segmento tetrapeptídico próximo do sítio tipo 1. As mutações F463M e F463L estavam na posição correspondente ao ligando metionina axial de cobre (M517) de tipo 1 em ascorbato oxidase de abobrinha. As mutações E460S e A461E estavam próximas do sítio de cobre T1. As lacases de Trametes mutadas foram expressas em um hospedeiro de Aspergillus oryzae e caracterizadas. A mutação E460S não conseguiu produzir um transformante com expressão significativa. As mutações F463L e A461E não alteraram significativamente as propriedades moleculares e enzimológicas da lacase. Em contraste, a mutação F463M resultou em um sítio de cobre do tipo 1 com um sinal EPR intermediário entre o da lacase e plastocianina do tipo selvagem, um espectro UV visível alterado e um potencial redox diminuído (em 0,1 V). No substrato fenólico oxidante, a mutação levou a um pH ótimo mais básico, bem como um aumento em kcat e Km. Estes efeitos são atribuídos a uma perturbação significativa do centro de cobre T1 causada pela coordenação do ligando metionina axial (M463).

 

F. Xu; R.M. Berka; J.A. Wahleithner; B.A. Nelson; J.R. Shuster; S.H. Brown; A.E. Palmer; E.I. Solomon.
"Site-directed mutations in fungal laccase: Effect on redox potential, activity and pH profile."
Biochem. J., 334, 63-70 (1998)

Resumo

Uma lacase de Myceliophthora thermophila e uma lacase de Rhizoctonia solani foram mutadas em um segmento pentapeptídico que se acredita estar próximo do sítio de Cu tipo 1. A mutação L513F na lacase de Myceliophthora e a mutação L470F na lacase de Rhizoctonia ocorreram em uma posição correspondente ao ligando metionina axial (M517) de Cu tipo 1 em ascorbato oxidase de abobrinha. As mutações triplas V509L, S510E, G511A na lacase de Myceliophthora e L466V, E467S, A468G na lacase de Rhizoctonia envolveram um segmento de sequência cujo homólogo em ascorbato oxidase é flanqueado pela M517 e uma histidina de ligação de Cu tipo 1 (H512). A mutação única não produziu mudanças significativas nas propriedades enzimáticas (incluindo qualquer aumento significativo no potencial redox do Cu tipo 1). Em contraste, a mutação tripla resultou em várias mudanças significativas. Em comparação com o tipo selvagem, os mutantes triplos de lacase de Rhizoctonia e Myceliophthora apresentaram uma atividade de fenol-oxidase cujo pH ótimo se alterou em 1 unidade, uma a menos e uma a mais, respectivamente. Embora os potenciais redox não tenham sido significativamente alterados, a inibição de fluoreto, Km e kcat das lacases foi altamente alterada pelas mutações. Os efeitos observados são interpretados como possíveis perturbações estruturais induzidas por mutação no reconhecimento molecular entre o substrato redutor e a lacase e na transferência de elétrons do substrato para o centro de Cu tipo 1.