Camilla Christiansen, Maher Abou Hachem, Esben Friis, Martin J. Baumann, Mikkel A. Glaring, Anders Viksø-Nielsen, Bent W, Sigurskjold, Birte Svensson and Andreas Blennow
"Exploring New Plant Carbohydrate Binding Modules (CBMs) from Glucan, Water Dikinase."
In: Starch Recent Progress in Biopolymer and Enzyme Technology. Tomasik, P., Bertoft, E. and Blennow A. (Editors). Polish Society of Food Technologists*, Chapter 7, pp. 85-102, ISBN 978-83-902699-7-X (2008)

Resumo

Os domínios de ligação de amido (SBDs, na sua sigla em inglês) são módulos distintos de reconhecimento de amido, frequentemente presentes em enzimas ativas de amido. Os SBDs são atribuídos em famílias de módulos de ligação a carboidratos (CBM, na sua sigla em inglês) com base em semelhanças estruturais primárias e dobras estruturais conservadas. Os SBDs da família CBM 20 são encontrados em Archaeas, bactérias e eucariotas e ocorrem em conjunto com uma variedade de domínios catalíticos em α-amilases, β-amilases, ciclodextrina glucosil transferases, glucoamilases, pululanases, glucano-água-diquinases (GWDs) e outros enzimas. Tipicamente, os SBDs facilitam a ligação de enzimas hidrolíticas extracelulares aos grânulos de amido e são considerados como motivos importantes para o desenvolvimento de enzimas com atividades aprimoradas e novas para a degradação efetiva do amido. Os membros da família CBM45 recentemente descoberta estão exclusivamente presentes em α-amilases plastidiais, cujo papel ainda é desconhecido e em GWDs implicados na fosforilação de amido. Curiosamente, o GWD plastidial de Arabidopsis thaliana GWD3 tem um SBD pertencente à família CBM20. O GWD3 SBD foi clonado e produzido para maior caracterização e comparação das propriedades de ligação com a família CBM20 bem caracterizada de glucoamilase (GA) de Aspergillus niger. A ligação ao mímico de amido de baixo peso molecular β-ciclodextrina e outros ligantes solúveis foi medida usando análise de ressonância de plasmão de superfície, e a microscopia de varredura a laser confocal foi utilizada para visualizar a ligação aos grânulos de amido. O Arabidopsis thaliana GWD3-SBD apresentou uma afinidade menor de 70 vezes à β-ciclodextrina do que a GA-SBD. A baixa afinidade dessas CBM vegetais intracelulares em comparação com a maioria dos outros domínios de ligação de amido, incluindo o A. niger CBM20, sugere a ligação reversível ou regulada das enzimas vegetais que contém SBD. Este é o primeiro relatório de um membro da família CBM20 vegetal isolada e destaca a presença de diferenças funcionais dentro da família CBM20.

 

Micheelsen, P.O., Vévodová, J., De Maria, L., Østergaard, P.R., Friis, E.P., Wilson, K., Skjøt, M.
"Structural and Mutational Analyses of the Interaction between the Barley α-Amylase/Subtilisin Inhibitor and the Subtilisin Savinase Reveal a Novel Mode of Inhibition"
Journal of Molecular Biology. Article in Press. (2008)

Resumo

As subtilisinas representam uma grande classe de serina-proteases microbianas. Até o momento, existem estruturas tridimensionais de inibidores proteináceos de três famílias em complexos com subtilisinas no Banco de Dados de Proteínas. Todas interagem com subtilisina através de uma volta exposta que abrange seis resíduos interativos. Aqui apresentamos a estrutura cristalina do complexo entre Bacillus lentus subtilisina Savinase e o inibidor de inibidor bifuncional de α-amilase e subtilisina de cevada (BASI). Essa é a primeira estrutura relatada de um inibidor da família Kunitz-P cereal em complexo com uma subtilisina. A análise estrutural revelou que o BASI inibe a Savinase de uma maneira nova, já que o ciclo de interação é menor do que as voltas previamente relatadas. A análise mutacional mostrou que Thr88 é crucial para a inibição, pois estabiliza o ciclo de interação através de interações intramoleculares com a estrutura do BASI. © 2008 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

 

Skálová, T., Dohnálek, J., Østergaard, L.H., Østergaard, P.R., Kolenko, P., Dušková, J., Hašek, J.
"Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the small laccase from Streptomyces coelicolor"
Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 63 (12), pp. 1077-1079. (2007)

Resumo

A pequena lacase bacteriana da actinobactéria Streptomyces coelicolor que não possui o segundo dos três domínios das lacases estruturalmente caracterizadas até o momento foi cristalizada. Esse fenol oxidase de cobre múltiplo cristaliza em uma malha primitiva tetragonal, com parâmetros de célula unitária a = b = 179,8, c = 175,3 Å. Os cristais pertencem a qualquer grupo espacial P41212 ou P43212. A função de autorrotação mostra a presença de um eixo trifásico não cristalográfico na estrutura. As fases serão determinadas a partir do sinal anômalo dos íons de cobre nativos. © International Union of Crystallography 2007.

 

Gloster, T.M., Ibatullin, F.M., Macauley, K., Eklöf, J.M., Roberts, S., Turkenburg, J.P., Bjørnvad, M.E., Jørgensen, P.L., Danielsen, S., Johansen, K.S., Borchert, T.V., Wilson, K.S., Brumer, H., Davies, G.J.
"Characterization and three-dimensional structures of two distinct bacterial xyloglucanases from families GH5 and GH12"
Journal of Biological Chemistry, 282 (26), pp. 19177-19189. (2007)

Resumo

A parede celular das plantas é um material complexo no qual as microfibrilas de celulose estão incorporadas dentro de uma malha de outros polissacarídeos, alguns dos quais são vagamente denominados "hemicelulose". Uma dessas hemiceluloses é o xiloglucano, que exibe uma estrutura de D-glicose ligada a β-1,4 substituída por porções de xilose, galactose e ocasionalmente fucose. Tanto o xiloglucano como as enzimas responsáveis pela sua modificação e degradação estão encontrando uma crescente proeminência, refletindo tanto o impulso para a conversão da biomassa enzimática, sua função nas aplicações de detergente quanto a utilidade de xiloglucanos modificados para a modificação da fibra de celulose. Aqui apresentamos a caracterização enzimática e as estruturas tridimensionais em formas complexadas de xiloglucano-oligossacarídeo e livres de ligante de duas xiloglucanases distintas de famílias de glicosídeo hidrolase GH5 e GH12. As enzimas, Paenibacillus pabuli XG5 e Bacillus licheniformis XG12, exibem sulcos centrais ativos abertos enxertados sobre as respectivas dobras de rolo do tipo (β/α)8 e β-jelly, nas quais as decorações da cadeia lateral do xiloglucano podem ser acomodadas. Para a topologia da enzima do rolo do tipo β-jelly de GH12, a ligação das porções de xilosil e galactosil pendente é tolerada, mas a enzima é similarmente competente na degradação de glucanos não ramificados. No caso da enzima (β/α)8 GH5, são feitas interações cineticamente produtivas com ambos os substituintes de xilose e galactose, como se reflete tanto numa atividade específica elevada quanto no xiloglucano e na cinética de uma série de arilglicosídeos. As estratégias diferenciais para o alojamento das cadeias laterais do xiloglucano podem, provavelmente, facilitar a ação dessas hidrolases microbianas em meios em que podem ser encontrados substratos diferentes e diferentemente substituídos. © 2007 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

 

Greenbaum, J.A., Andersen, P.H., Blythe, M., Bui, H.-H., Cachau, R.E., Crowe, J., Davies, M., Kolaskar, A.S., Lund, O., Morrison, S., Mumey, B., Ofran, Y., Pellequer, J.-L., Pinilla, C., Ponomarenko, J.V., Raghava, G.P.S., Van Regenmortel, M.H.V., Roggen, E.L., Sette, A., Schlessinger, A., Sollner, J., Zand, M., Peters, B.

"Towards a consensus on datasets and evaluation metrics for developing B-cell epitope prediction tools"
Journal of Molecular Recognition, 20 (2), pp. 75-82. (2007)

Resumo

Um epítopo de células B é a estrutura tridimensional dentro de um antígeno que pode ser ligado à região variável de um anticorpo. A predição de epítopos de células B é altamente desejável para várias aplicações imunológicas, mas tem apresentado um conjunto de desafios únicos para as comunidades de bioinformática e imunologia. Melhorar a precisão dos métodos de predição de epítopo de células B depende de um consenso da comunidade sobre os dados e métricas utilizados para desenvolver e avaliar tais ferramentas. Um workshop, patrocinado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID, na sua sigla em inglês), foi recentemente realizado em Washington, DC, para discutir o estado atual do campo de predição do epítopo das células B. Muitas das ferramentas atualmente disponíveis foram pesquisadas e um conjunto de recomendações foi elaborado para facilitar melhorias nas ferramentas atualmente existentes e acelerar o futuro desenvolvimento de ferramentas. Um tema subjacente das recomendações apresentadas pelo painel é o aumento da colaboração entre os grupos de pesquisa. Ao desenvolver conjuntos de dados comuns, formatos de dados padronizados e os meios para consolidar as informações, esperamos melhorar muito o desenvolvimento de ferramentas de predição de epítopos de célula B. Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd.


Mirza, O., Skov, L.K., Sprogøe, D., Van Den Broek, L.A.M., Beldman, G., Kastrup, J.S., Gajhede, M.
"Structural rearrangements of sucrose phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis during sucrose conversion"
Journal of Biological Chemistry, 281 (46), pp. 35576-35584. (2006)

Resumo

O mecanismo de reação da sacarose fosforilase de Bifidobacterium adolescentis (BiSP) foi estudado por mutagênese direcionada ao local e cristalografia de raios-x. Um mutante inativo de BiSP (E232Q) foi cocristalizado com sacarose. A estrutura revelou um modo de ligação ao substrato comparável ao observado em outras enzimas relacionadas à sacarose ativa. O BiSP de tipo selvagem também foi cristalizado na presença de sacarose. Na estrutura dimérica, um intermediário de glucosil covalente foi formado em uma molécula do dímero de BiSP, e após a hidrólise do intermediário de glucosil, formou-se um complexo de produto de β-D-glicose na outra molécula. Embora a estrutura global do complexo intermediário BiSP-glucosil seja semelhante à do complexo BiSP (E232Q)-sacarose, o complexo de glicose revela diferenças importantes nas conformações do loop. Dois loops (resíduos 336-344 e 132-137) na proximidade do sítio ativo movem-se até 16 e 4 Å, respectivamente. Com base nessas descobertas, sugerimos um ciclo de reação que leva em consideração os grandes movimentos nos loops de entrada do sítio ativo. © 2006 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Lyhne-Iversen, L., Hobley, T.J., Kaasgaard, S.G., Harris, P.
"Structure of Bacillus halmapalus α-amylase crystallized with and without the substrate analogue acarbose and maltose"
"Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 62 (9), pp. 849-854. (2006)

Resumo

A α-amilase recombinante de Bacillus halmapalus (BHA) foi estudada em duas formas cristalinas diferentes. A primeira forma cristalina foi obtida por cristalização de BHA à temperatura ambiente na presença de acarbose e maltose; os dados foram coletados à temperatura criogênica para uma resolução de 1,9 Â. Verificou-se que o cristal pertencia ao grupo espacial P21212 1, com parâmetros da célula unitária a = 47,0, b = 73,5, c = 151,1 Å. Uma molécula de maltose foi observada e encontrada para se ligar a BHA e os relatos anteriores da ligação de um nonassacarídeo foram confirmados. A segunda forma de cristal foi obtida por cristalização induzida por pH de BHA num tampão de MES-HEPES-ácido bórico (tampão MHB) a 303 K; a solubilidade de BHA em MHB tem uma dependência de temperatura retrógrada e a cristalização de BHA só foi possível aumentando a temperatura para pelo menos 298 K. Os dados foram coletados à temperatura criogênica a uma resolução de 2,0 Å. O cristal pertencia ao grupo espacial P2 12121, com parâmetros de célula unitária a = 38,6, b = 59,0, c = 209,8 Å. A estrutura foi resolvida usando a substituição molecular. O sítio de ligação à maltose é descrito, e as duas estruturas são comparadas. Não foram observadas alterações significativas na estrutura após a ligação dos substratos. © 2006 International Union of Crystallography Todos os direitos reservados.

 

Von Ossowski, I., Eaton, J.T., Czjzek, M., Perkins, S.J., Frandsen, T.P., Schülein, M., Panine, P., Henrissat, B., Receveur-Bréchot, V.
"Protein disorder: Conformational distribution of the flexible linker in a chimeric double cellulase"
Biophysical Journal, 88 (4), pp. 2823-2832. (2005)

Resumo

As propriedades estruturais do peptídeo ligante que liga o módulo de ligação à celulose ao módulo catalítico nas celulases bimodulares foram investigadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Como o vinculador e o módulo de ligação à celulose são relativamente pequenos e não podem ser facilmente detectados separadamente, a conformação do ligante foi estudada por meio de uma proteína de fusão artificial, Cel6BA, na qual um ligador de 88 resíduos conecta os grandes módulos catalíticos das celulases Cel6A e Cel6B da Humicola insolens. Nossos dados mostraram que a Cel6BA é muito alongada, com uma dimensão máxima de 178 A, mas não pode ser descrita por uma única conformação. A modelagem de uma série de conformadores de Cel6BA com separações de interdomínio variando entre 10 Å e 130 Å mostrou que os bons ajustes do perfil Guinier e P(r) foram obtidos por uma média ponderada das curvas de espalhamento de todos os modelos, em que o vinculador segue uma distribuição não aleatória, com preferência pelos conformadores mais compactos. Essas propriedades estruturais provavelmente serão essenciais para a função do vinculador como uma mola molecular entre os dois módulos funcionais. O espalhamento de raios-X a baixo ângulo, portanto, fornece uma ferramenta única para analisar quantitativamente o transtorno conformacional típico das proteínas descritas como nativamente desdobradas. © 2005 by the Biophysical Society.

 

Davies, G.J., Marek Brzozowski, A., Dauter, Z., Rasmussen, M.D., Borchert, T.V., Wilson, K.S.

"Structure of a Bacillus halmapalus family 13 α-amylase, BHA, in complex with an acarbose-derived nonasaccharide at 2,1 Å resolution"Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 61 (2), pp. 190-193. (2005)

Resumo

A digestão enzimática do amido por α-amilases é uma das principais reações biotecnológicas dos últimos tempos. Na busca por biocatalisadores industriais, a família GH13 α-amilase BHA de Bacillus halmapalus foi clonada e expressa. A estrutura tridimensional com uma resolução de 2,1 Â foi determinada em complexo com o inibidor de (pseudo) tetrassacarídeo acarbose. A acarbose é encontrada como um produto de transglicosilação de não acarídeo abrangendo os subsítios de -6 a +3. A inspeção cuidadosa da densidade de elétrons sugere que o ligante ligado não poderia ter sido formado através de transglicosilações sucessivas de acarbose e também deve ter apresentado maltose ou malto-oligossacarídeos como aceitador. © 2005 International Union of Crystallography — todos os direitos reservados.

 

Ryttersgaard, C., Le Nours, J., Lo Leggio, L., Jørgensen, C.T., Christensen, L.L.H., Bjørnvad, M., Larsen, S.
"The structure of endo-β-1,4-galactanase from Bacillus licheniformis in complex with two oligosaccharide products"
Journal of Molecular Biology, 341 (1), pp. 107-117. (2004)

Resumo

A β-1,4-galactanase de Bacillus licheniformis (BLGAL) é uma enzima degradante da parede celular vegetal envolvida na hidrólise do β-1,4-galactano nas regiões peludas da pectina. A estrutura cristalina de BLGAL foi determinada por reposição molecular sozinha e complexa com os produtos galactobiose e galactotriose, capturando um primeiro vislumbre cristalográfico de fragmentos de β-1,4-galactano. Como esperado para uma enzima pertencente à família GH-53, a estrutura BLGAL revela uma arquitetura de barril (βα)8. No entanto, os βα-loops 2, 7 e 8 de BLGAL são longos em contraste com os loops correspondentes em estruturas de galactanases fúngicas determinadas anteriormente. A estrutura de BLGAL mostra adicionalmente um íon de cálcio que liga os longos βα-loops 7 e 8, que substitui uma ponte de dissulfureto nas galactanases fúngicas. Comparado com os subsítios de ligação do substrato previstos para Aspergillus aculeatus galactanase (AAGAL), dois subsítios adicionais para a ligação ao substrato são encontrados em BLGAL, -3 e -4. Uma comparação do padrão de degradação de galactano e galacto-oligossacarídeos por AAGAL e BLGAL mostra que, embora ambos sejam mais ativos em substratos com um alto grau de polimerização, o AAGAL pode degradar a galactotriose e a galactotetraose de forma eficiente, enquanto que BLGAL prefere oligossacarídeos mais longos e não pode hidrolisar a galactotriose em qualquer medida apreciável. Essa diferença na preferência do substrato pode ser explicada estruturalmente pela presença dos subsítios extras -3 e -4 em BLGAL. © 2004 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

 

McAuley, K.E., Svendsen, A., Patkar, S.A., Wilson, K.S.
"Structure of a feruloyl esterase from Aspergillus niger"
Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 60 (5), pp. 878-887. (2004)

Resumo

A estrutura cristalográfica de feruloil esterase de Aspergillus niger foi determinada a uma resolução de 1,5 Å por substituição molecular. A proteína tem uma estrutura de α/β-hidrolase com uma tríade catalítica Ser-His-Asp; a dobra geral da proteína é muito semelhante à das alterações fúngicas. A estrutura do complexo enzima-produto foi determinada a uma resolução de 1,08 Â e revela conformações duais para os resíduos de serina e histidina no sítio ativo. © 2004 International Union of Crystallography. Impresso na Dinamarca — todos os direitos reservados.

 

J. Le Nours; C. Ryttersgaard; L.L. Leggio; P.R. Østergaard; T.V. Borchert; L.L.H. Christensen; S. Larsen.
"Structure of two fungal beta-1,4-galactanases: Searching for the basis for temperature and pH optimum."
Protein Science, 12, 1195-1204 (2003)

Resumo

As beta-1, 4-galactanases hidrolizam as cadeias laterais de galactano que fazem parte da estrutura complexa de carboidratos de pectina. Eles são designados para a família 53 das hidrolases de glicosídeos e exibem variações significativas em seu pH e temperatura otimizadas e estabilidade. Duas beta-1, 4-galactanases fúngicas de Myceliophthora thermophila e Humicola insolens foram clonadas e expressas heterologicamente, e as estruturas cristalinas dos produtos do gene foram determinadas. As estruturas foram comparadas com a estrutura da galactanase de Aspergillus aculeatus (AAGAL) anteriormente conhecida apenas da família 53 mostrando identidade semelhante a 56%. As galactanases M. thermophila e H. insolens são enzimas termofílicas e são mais ativas em pH neutro a básico, enquanto a AAGAL é mesofílica e mais ativa em pH ácido. A estrutura da M. thermophila galactanase (MTGAL) foi determinada a partir de cristais obtidos com tampões HEPES e TRIS a resolução 1,88 Angstrom e 2,14 Angstrom, respectivamente. A estrutura da H. insolens galactanase (HIGAL) foi determinada a uma resolução de 2,55 Angstrom. A termoestabilidade de MTGAL e HIGAL correlaciona-se com aumento da rigidez proteica e das interações eletrostáticas, estabilização das hélices-a e uma embalagem mais apertada. Uma inspeção dos sítios ativos nas três enzimas identificou várias substituições de aminoácidos que poderiam explicar a variação no pH ideal. O exame da atividade como uma função do pH para o mutante D182N de AAGAL e do mutante A90S/H91D de MTGAL mostrou que a diferença no pH ideal entre AAGAL e MTGAL está, pelo menos parcialmente, associada a diferenças na natureza dos resíduos nas posições 182, 90 e/ou 91.

 

W. Receveur; M. Czjzek; M. Schulein; P. Panine; B. Henrissat.
"Dimension, shape, and conformational flexibility of a two domain fungal cellulase in solution probed by small angle X- ray scattering."
J. Biol. Chem., 277(43), 40887-40892 (2002)

Resumo

A celulase Ce145 de Humicola insolens tem uma estrutura modular com um módulo catalítico e um módulo de ligação à celulose (CBM, na sua sigla em inglês) separados por um peptídeo ligador glicosilado de 36 aminoácidos. A conformação da solução de toda a proteína Ce145 de dois domínios, bem como o efeito do comprimento e flexibilidade do ligador na disposição espacial dos módulos constitutivos foram estudados por espalhamento de raios X a baixo ângulo combinado com a estrutura tridimensional conhecida dos módulos individuais. As dimensões medidas da enzima mostram que o ligador exibe uma conformação prolongada que leva a uma extensão máxima entre os dois centros de massa de cada módulo, correspondendo a cerca de quatro unidades de celobiose em uma cadeia de celulose. A glicosilação do ligador é o principal fator que define sua conformação estendida, e uma mutação de alongamento de cinco prolinas no ligador conferiu maior rigidez à enzima. Nosso estudo mostra que o posicionamento respectivo do módulo catalítico e do CBM sobre o substrato insolúvel é provavelmente influenciado pela estrutura do ligador e pela flexibilidade. Nossos resultados são consistentes com um modelo em que as celulases podem se mover na superfície da celulose com um deslocamento semelhante a uma lagarta com restrições de energia gratuitas.

 

J. E. Nielsen; T. V. Borchert; G. Vriend.
"The determinants of alpha-amylase pH activity profiles."
Protein engineering, 14, 505-512 (2001)

Resumo

As hidrolases de glicosil apresentam uma grande família de enzimas que são de grande importância para a indústria. Consequentemente, existe um interesse considerável na engenharia das enzimas dessa família para um desempenho ideal sob uma gama de condições muito diversas. Até recentemente, a adaptação de glicosil hidrolases para processos industriais específicos envolvia principalmente a engenharia de estabilidade, mas ultimamente também houve um interesse considerável na engenharia de seus perfis de atividade de pH. Realizamos a mutação de quatro resíduos neutros (N190, F290, N326 e Q360) na alfa-amilase Bacillus Ba2 quimérica para ambos os aminoácidos carregados e neutros. Os resultados mostram que o perfil de atividade de pH da alfa-amilase Ba2 pode ser alterado pela inserção de resíduos carregados próximos ao sítio ativo. As mudanças no perfil de atividade do pH para essas mutações neutras -> carregadas, no entanto, não se correlacionam com as previsões dos cálculos dos valores de pK(a) dos resíduos do sítio ativo. Mais surpreendentemente, as mutações neutras -> neutras alteram o perfil de atividade do pH tanto quanto as mutações neutras -> carregadas. A partir desses resultados, conclui-se que outros fatores além da eletrostática, presumivelmente os aspectos dinâmicos do sítio ativo, são importantes para a forma dos perfis de atividade do pH das alfa-amilases.

 

E. Sabini; K.S: Wilson; S. Danielsen; M. Schulein; G.J. Davies.
"Oligosaccharide binding to family 11 xylanases: both covalent intermediate and mutant product complexes display B-2,B-5 conformations at the active centre."
Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 57, 1344-1347 (2001)

Resumo

A classificação baseada em sequência de glicosídeo hidrolase revela duas famílias de enzimas que hidrolizam a estrutura de xilano, xilanases, denominadas famílias GH-10 e GH-11, linhagens de linfócitos L-1 e 4 GH-11. As xilanases da família GH-11 são intrigantes, já que a catálise é realizada através de um intermediário covalente adotando uma conformação B-2, B-5 (barco) incomum, uma conformação que também atende às restrições estereoquímicas do estado de transição similar ao iôn do oxocarbeno. Aqui, apresenta-se a estrutura 1,9 Angstrom de um nucleófilo, E94A, mutante do Xyn11 de Bacillus agaradhaerens em complexo com xilotriose. De maneira intrigante, esse complexo também adota a conformação B-2, B-5 no subsítio-1, com o espaço livre fornecido pela mutação Glu -> Ala, permitindo que o açúcar adote a configuração alfa em C1. A estrutura do intermediário covalente da enzima 2-desoxi-2-fluoroxilobiosil foi estendida a uma resolução atômica (1,1 Angstrom).
K. Zhu; A. Jutila; E.K.J. Tuominen; S.A. Patkar; A. Svendsen; P.K.J. Kinnunen.
"Impact of the tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability."
Biochim. Biophys. Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology, 1547, 329-338 (2001)

Resumo

Foi comparada a estabilidade térmica da lipase de Humicola lanuginosa de tipo selvagem (Wt HLL) com seus dois mutantes, W89L e o mutante único Trp W89m (W117F, W221H e W260H). A calorimetria de varredura diferencial revelou desdobramento de HLL em T-d = 74,4 °C, enquanto que para W89L e W89m, esta endotermia diminuiu para 68,6 e 62 °C, respectivamente, demonstrando contribuição significativa dos resíduos Trp acima para a estabilidade estrutural de HLL. Os espectros de emissão de fluorescência revelaram que o microambiente médio de Trps de wt HLL e W89L ficou mais hidrofílicos a temperaturas elevadas, enquanto o oposto ocorreu para W89m. Essas mudanças nas emissões no estado estável foram acentuadas, com pontos médios (T-m) em aprox. 70,5, 61,0 e 65,5 ºC para wt HLL, W89L e W89m, respectivamente. Tanto a espectroscopia de fluorescência estável quanto a resolução de tempo indicaram ainda que, ao aumentar a temperatura, os movimentos locais de triptofano(s) nessas lipases foram atenuados pela primeira vez. Contudo, mobilidades mais rápidas tornaram-se evidentes quando as temperaturas de desdobramento (T-m) foram excedidas, e as lipases tornaram-se menos compactas, como indicado pelo aumento dos raios hidrodinâmicos. Mesmo a altas temperaturas (até 85 ºC), uma grande extensão da estrutura terciária e secundária foi revelada pelo dicroísmo circular. As medidas de atividade estão de acordo com amplitudes aumentadas de flutuações conformacionais de HLL com temperatura. Nossos resultados também indicam que o desdobramento térmico dessas lipases não é um processo de dois estados, mas envolve estados intermediários. Curiosamente, um ciclo de aquecimento e resfriamento aumentou a atividade das lipases, sugerindo que a proteína fique presa em um estado de energia intermediário e superior. Os dados atuais mostram que as mutações, especialmente W89L na tampa, contribuem significativamente para a estabilidade, estrutura e atividade de HLL.

 

L. Beier; A. Svendsen; C. Andersen; T. P. Frandsen; T. V. Borchert; J.R. Cherry.
"Conversion of the maltogenic alpha-amylase into a CGT'ase."
Protein Engineering ,13,  509-513 (2000)

Resumo

A novamil é uma alfa-amilase maltogênica termostática de cinco domínios que mostra sequência e homologia estrutural com ciclodextrina glicosiltransferases (CGTases), comparando as estruturas cristalinas de raios-X da novamil e CGTases, observaram-se duas diferenças principais na fenda do sítio ativo: a novamil contém uma inserção de loop constituída por cinco resíduos (resíduos 191-195) e a localização de um resíduo aromático essencial para obter uma reação de ciclização eficiente. Para converter a novamil em uma enzima produtora de ciclodextrina (CD), o loop foi excluído e foram introduzidas duas substituições, F188L e T189Y. Ao contrário da novamil original, a variante obtida é capaz de produzir beta-CD e mostrou uma conversão global de amido em CD de 9%, em comparação com as CGTases que são capazes de converter até 40%. A menor conversão em comparação com a CGTase provavelmente deve-se a diferenças adicionais na fenda no sítio ativo e no domínio E de ligação de amido. Uma variante com apenas o loop de cinco resíduos excluído não conseguiu formar o beta-CD.

 

A.M. Brzozowski; H. Savage; C.S. Verma; J.P.D.M. Lawson; A. Svendsen; S.A. Patkar.
"Structural origins of the interfacial activation on Thermomyces (Humicola) lanuginosa lipase."
Biochemistry, 39,15071-15082 (2000)

Resumo

As já conhecidas estruturas de raios-X de lipases fornecem poucas evidências sobre as etapas estruturais iniciais discretas que ocorrem nas primeiras fases de sua ativação na presença de lipídios (processo conhecido como ativação interfacial). Para abordar esse problema, foram resolvidas cinco novas estruturas de cristal de lipase (TIL) de Thermomyces (anteriormente Humicola) lanuginosa e comparadas com quatro estruturas anteriormente relatadas dessa enzima. O viés proveniente de diferentes meios de cristalização foi minimizado pelo crescimento de todos os cristais nas mesmas condições de cristalização, na presença de análogos detergentes/lipídicos, com baixa ou alta força iônica como única variável principal. As estruturas resultantes e suas características permitiram a identificação de três espécies estruturalmente distintas dessa enzima: forma de baixa atividade (LA), forma ativada (A) e totalmente ativa (FA). A isomerização do dissulfeto Cys268-Cys22, sincronizado com a formação de uma alfa (0) hélice nova e curta e flipping do Arg84 (interruptor de arginina) localizada na dobradiça proximal da tampa, foram postulados como fatores importantes e estruturais das transições iniciais entre as formas LA e A. Os resultados experimentais foram complementados por cálculos teóricos. A magnitude da barreira de ativação entre as formas de LA (estado fundamental) e A (estado final) de TIL (10,6 kcal/mol) é comparável às barreiras entálpicas típicas para as voltas do anel e as isomerizações de dissulfeto à temperatura ambiente. Isso sugere que a sequência das mudanças estruturais, como exemplificado em várias estruturas de cristal de TlL, espelha aquelas que podem ocorrer durante a ativação interfacial.